本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、子宮肌的收縮功能在妊娠的維持和啟動(dòng)當(dāng)中起著關(guān)鍵的作用，子宮肌從靜息到收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變的調(diào)控機(jī)制，以及子宮肌收縮過程中有哪些因子參與調(diào)控，目前仍然沒有得到徹底的闡明。因?yàn)闄C(jī)制的不清除，目前臨床上對于早產(chǎn)、宮縮乏力等與子宮肌收縮功能相關(guān)的疾病的治療手段仍舊相對缺乏，難以達(dá)到穩(wěn)定且高效的治療效果。

2、孕期子宮肌可分為4個(gè)階段：靜息期、分娩前的激活期、分娩時(shí)的收縮期、產(chǎn)后的復(fù)原期。靜息期：在妊娠的第36-38周，子宮肌在孕激素和松弛素的狀態(tài)下處于舒張狀態(tài)。激活期：在妊娠最后的2-4周，子宮肌由靜息期向收縮期過渡并被激活，可以出現(xiàn)弱而不規(guī)則的子宮收縮。此時(shí)，會出現(xiàn)子宮肌和宮頸結(jié)構(gòu)和功能的明顯變化，例如子宮肌細(xì)胞間縫隙連接增加，縮宮素和前列腺素受體等收縮相關(guān)蛋白大量增加，子宮肌對縮宮素和前列腺素的反應(yīng)增強(qiáng)以及宮頸軟化成熟及子宮下段形成等。收縮期：分娩發(fā)動(dòng)時(shí)，子宮肌對縮宮素和前列腺素的敏感性進(jìn)一步加強(qiáng)，從不規(guī)則收縮發(fā)展為有節(jié)律的強(qiáng)烈收縮。復(fù)原期：子宮肌的收縮減弱，逐步向妊娠之前的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。在這大約40周的時(shí)間內(nèi)，子宮肌細(xì)胞需要從靜息、增殖表型、合成表型等，再到分娩時(shí)期的收縮表型的轉(zhuǎn)換。如果表型轉(zhuǎn)換的過程中發(fā)生異常，可能導(dǎo)致最終的分娩階段子宮肌不能維持應(yīng)有的收縮功能，例如子宮肌過早的收縮，表現(xiàn)為早產(chǎn)，或者子宮肌收縮能力不足，表現(xiàn)為產(chǎn)程延長，宮縮乏力。

3、子宮收縮乏力是產(chǎn)后出血的基礎(chǔ)病因，一項(xiàng)大型全球隨機(jī)對照試驗(yàn)的數(shù)據(jù)提示子宮收縮乏力占所有產(chǎn)后出血病例的30-80％。目前針對子宮收縮乏力的治療藥物有縮宮素、麥角新堿、米索前列醇等，這些藥物的作用有時(shí)不夠理想，還可能帶來一系列心血管影響，包括低血壓、心動(dòng)過速、st段抑制、心肌缺血和心律失常。進(jìn)一步的治療方式有子宮按摩，子宮填塞，子宮壓縮縫合，但有可能導(dǎo)致宮壞死和宮內(nèi)粘連。當(dāng)上述方法失效時(shí)，為了挽救生命，可以選擇雙側(cè)子宮動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)、髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，甚至子宮切除術(shù)，這將無法保留正常的生育功能。

4、目前，對于子宮收縮乏力的研究，可以使用野生型小鼠，在小鼠懷孕后臨產(chǎn)前，注射藥物干預(yù)，使得小鼠發(fā)生宮縮乏力的表型。但單獨(dú)給藥造模的方式仍然存在局限性，而基因敲除造?？梢愿玫貙ψ訉m收縮乏力進(jìn)行研究。另外，由于人體實(shí)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)制約，動(dòng)物模型成為研究宮縮乏力發(fā)生發(fā)展及探索防治措施的重要工具，然而目前尚未有表型穩(wěn)定且可供大量繁育的宮縮乏力動(dòng)物模型。因此，本領(lǐng)域需要一種宮縮乏力的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明提供一種宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，所述方法包括通過特異性敲除小鼠的子宮平滑肌cbs基因，構(gòu)建宮縮乏力小鼠模型。

2、在一種具體的實(shí)施方式中，將loxp序列插入小鼠cbs基因的兩端而用于標(biāo)記并有效敲除cbs基因，得到的在cbs基因的兩端插入有l(wèi)oxp序列的小鼠命名為loxp-flox-cbs小鼠，或稱為cbsf/f小鼠；之后，將loxp-flox-cbs小鼠與攜帶tagln-cre酶的工具小鼠相交配并與loxp-flox-cbs小鼠回交純化，得到所述宮縮乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠，或稱為cbsd/d小鼠；所述tagln-cre酶為平滑肌驅(qū)動(dòng)的cre。

3、在一種具體的實(shí)施方式中，得到所述宮縮乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠后，將模型小鼠cbsf/f/tagln-cre小鼠的雄鼠與對照小鼠cbsf/f小鼠的雌鼠合籠，以繁育更多的模型小鼠cbsd/d小鼠和對照小鼠cbsf/f小鼠。

4、在一種具體的實(shí)施方式中，雌雄合籠比例為3:1或以上。

5、在一種具體的實(shí)施方式中，在構(gòu)建小鼠模型的最開始時(shí)選擇雌性cbsf/f小鼠攜帶flox序列，而雄性小鼠為攜帶tagln-cre酶的工具小鼠。

6、本發(fā)明中，所述flox序列即loxp序列。

7、在一種具體的實(shí)施方式中，所述小鼠為spf級c57bl/6小鼠。

8、本發(fā)明還提供一種宮縮乏力小鼠模型的應(yīng)用，包括所述構(gòu)建方法制備得到的宮縮乏力小鼠模型用于治療和/或預(yù)防動(dòng)物和人類宮縮乏力的藥物開發(fā)。

9、本發(fā)明還提供一種篩選用于治療和/或預(yù)防動(dòng)物和人類宮縮乏力的藥物的方法，所述方法包括如下步驟：

10、1)將待測試藥物施用于權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的小鼠模型中；

11、2)分析待測試藥物的治療效果并進(jìn)行評價(jià)，選擇能夠明顯改善模型小鼠病理特征的測試藥物。

12、本發(fā)明具有以下有益效果：

13、1、本發(fā)明采用小鼠模型模擬人體自然狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以研究發(fā)病機(jī)制和治療，降低了在人體實(shí)施實(shí)驗(yàn)的必要性，避免了人體實(shí)驗(yàn)的倫理糾紛。

14、2、全身敲除cbs將導(dǎo)致小鼠在胚胎時(shí)期死亡，本發(fā)明通過特異性敲除子宮平滑肌細(xì)胞的cbs基因構(gòu)建宮縮乏力小鼠模型，小鼠存活率高且敲除效率高，構(gòu)建成功后表型穩(wěn)定，不會隨著時(shí)間和交配次數(shù)增加而出現(xiàn)癥狀緩解或消失等情況。

15、3、發(fā)明中宮縮乏力模型的病理表現(xiàn)有分娩啟動(dòng)時(shí)間推遲，產(chǎn)程延長，子宮肌收縮乏力等表型。與人類宮縮乏力的病理改變相符，能夠較好地模擬人體自然疾病狀態(tài)，有較好的代表性。

16、4、本發(fā)明中小鼠模型發(fā)生宮縮乏力的表型明顯，可以填補(bǔ)目前缺少相關(guān)動(dòng)物模型的空白，有利于觀察并設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)和開發(fā)相關(guān)藥物。

17、5、本發(fā)明可以從基因、蛋白質(zhì)、組織器官等多個(gè)方面多個(gè)角度對基因敲除進(jìn)行驗(yàn)證和觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、可信、有說服力。

18、總的來說，本發(fā)明通過條件性敲除子宮平滑肌細(xì)胞cbs基因，構(gòu)建宮縮乏力的小鼠模型，該小鼠模型具有分娩啟動(dòng)時(shí)間推遲，產(chǎn)程延長，子宮肌收縮乏力等表型，與人類宮縮乏力的癥狀及病理過程相符，操作可控性好、穩(wěn)定性佳。本發(fā)明的宮縮乏力小鼠模型可用于研究宮縮乏力的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治措施，以及用于新藥的開發(fā)和研究。此外，通過條件性基因敲除所構(gòu)建的小鼠模型，可以進(jìn)一步系統(tǒng)地探究在妊娠之前以及妊娠早期階段子宮肌發(fā)生轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制。

技術(shù)特征：

1.一種宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括通過特異性敲除小鼠的子宮平滑肌cbs基因，構(gòu)建宮縮乏力小鼠模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，將loxp序列插入小鼠cbs基因的兩端而用于標(biāo)記并有效敲除cbs基因，得到的在cbs基因的兩端插入有l(wèi)oxp序列的小鼠命名為loxp-flox-cbs小鼠，或稱為cbsf/f小鼠；之后，將loxp-flox-cbs小鼠與攜帶tagln-cre酶的工具小鼠相交配并與loxp-flox-cbs小鼠回交純化，得到所述宮縮乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠，或稱為cbsd/d小鼠；所述tagln-cre酶為平滑肌驅(qū)動(dòng)的cre。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，得到所述宮縮乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠后，將模型小鼠cbsf/f/tagln-cre小鼠的雄鼠與對照小鼠cbsf/f小鼠的雌鼠合籠，以繁育更多的模型小鼠cbsd/d小鼠和對照小鼠cbsf/f小鼠。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，雌雄合籠比例為3:1或以上。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，在構(gòu)建小鼠模型的最開始時(shí)選擇雌性cbsf/f小鼠攜帶flox序列，而雄性小鼠為攜帶tagln-cre酶的工具小鼠。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述小鼠為spf級c57bl/6小鼠。

7.一種宮縮乏力小鼠模型的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述構(gòu)建方法制備得到的宮縮乏力小鼠模型用于治療和/或預(yù)防動(dòng)物和人類宮縮乏力的藥物開發(fā)。

8.一種篩選用于治療和/或預(yù)防動(dòng)物和人類宮縮乏力的藥物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種宮縮乏力小鼠模型的構(gòu)建方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明通過特異性敲除子宮平滑肌CBS基因，構(gòu)建宮縮乏力小鼠模型，該小鼠模型具有分娩啟動(dòng)時(shí)間延遲，產(chǎn)程延長，子宮肌收縮乏力的特征性癥狀，與人類宮縮乏力的癥狀及病理過程相符，操作可控性好、穩(wěn)定性佳。本發(fā)明所述方法構(gòu)建的小鼠模型可用于研究宮縮乏力發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治措施，以及用于新藥的開發(fā)和研究。

技術(shù)研發(fā)人員：倪鑫,羅杰豐,唐政山
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10