本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、t細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域(tim)家族是最近發(fā)現(xiàn)的跨膜分子群，與6個(gè)半胱氨酸共享1個(gè)免疫球蛋白變量(igv)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在小鼠中有8個(gè)成員(tim1-tim8)，在人類中有3個(gè)成員(tim1、tim3和tim4)。tims參與調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，如過敏、哮喘、自身免疫和移植耐受。

2、tim-4(又timd4)是tim家族的成員之一，主要作為磷脂酰絲氨酸受體，增強(qiáng)凋亡細(xì)胞的吞噬。免疫染色顯示脾臟、淋巴結(jié)、等組織中吞噬活性細(xì)胞表達(dá)timd4。大量研究表明timd4是一種新分子，與慢性炎癥密切相關(guān)，如胃腸炎、特應(yīng)性皮炎和哮喘。此外，timd4在成纖維細(xì)胞中的過表達(dá)賦予“功能增益”并增強(qiáng)凋亡細(xì)胞的攝入。目前，對(duì)timd4基因的研究多集中在吞噬性細(xì)胞中，對(duì)其在非吞噬細(xì)胞中的功能研究較少，因此，研究timd4在乳腺上皮細(xì)胞感染中的作用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明目的是提供timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法及應(yīng)用，以山羊原代乳腺上皮細(xì)胞為材料，采用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，將編碼timd4基因的啟動(dòng)子替換為內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子，以達(dá)到高表達(dá)的目的。獲得陽性克隆細(xì)胞系后，通過定量和蛋白免疫印跡評(píng)價(jià)重組效率，通過lps誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)評(píng)價(jià)timd4基因在乳腺炎模型中的功能，獲得穩(wěn)定過表達(dá)山羊timd4基因和抗炎的乳腺上皮細(xì)胞。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

3、timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，

4、利用基因編輯技術(shù)，將編碼timd4基因的啟動(dòng)子替換為內(nèi)源性強(qiáng)表達(dá)b-actin基因的啟動(dòng)子，將timd4基因過表達(dá)，獲得穩(wěn)定過表達(dá)山羊timd4基因的原代乳腺上皮細(xì)胞；

5、具體包括如下步驟：

6、s1.修復(fù)片段b-actin啟動(dòng)子的擴(kuò)增：以山羊的基因組dna為模版，通過pcr擴(kuò)增b-actin啟動(dòng)子并純化；所述b-actin啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

7、s2.timd4基因左同源臂、右同源臂的擴(kuò)增：以山羊timd4的基因組dna為模版，將timd4基因5’utr前后各1kb作為左、右同源臂，進(jìn)行pcr擴(kuò)增并純化；所述timd4基因左同源臂的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；timd4基因右同源臂的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

8、s3.donor線性骨架制備：將pz-tomato質(zhì)粒經(jīng)sal?i內(nèi)切酶和hind?iii內(nèi)切酶雙酶切，純化，獲得donor線性骨架；

9、s4.構(gòu)建pz-tomato-timd4質(zhì)粒：將s1獲得的b-actin啟動(dòng)子、s2獲得的timd4基因左同源臂、右同源臂片段進(jìn)行酶切，連接，獲得同源臂片段：左同源臂-啟動(dòng)子-右同源臂；將所述同源臂片段與s3獲得的donor線性骨架連接，構(gòu)建pz-tomato-timd4質(zhì)粒；

10、s5.構(gòu)建px459-timd4質(zhì)粒：確定timd4基因啟動(dòng)子的pam位點(diǎn)，構(gòu)建雙鏈grna片段；px459載體bbs?i酶切后，將雙鏈grna片段連接px459質(zhì)粒載體，獲得px459-timd4質(zhì)粒；

11、s6.將s5獲得的px459-timd4質(zhì)粒和s4獲得的pz-tomato-timd4質(zhì)粒按照質(zhì)量比1:1電轉(zhuǎn)入山羊乳腺上皮細(xì)胞，抗性篩選，得到穩(wěn)定過表達(dá)山羊timd4基因的乳腺上皮細(xì)胞。

12、優(yōu)選的，

13、所述grna的序列如seq?id?no.10，seq?id?no.11所示。

14、優(yōu)選的，

15、所述s1中修復(fù)片段b-actin啟動(dòng)子的擴(kuò)增采用的引物的序列如seq?id?no.4，seqid?no.5所示。

16、優(yōu)選的，

17、所述s2中timd4基因的左同源臂擴(kuò)增采用的引物的序列如seq?id?no.6，seq?idno.7所示；timd4基因的右同源臂擴(kuò)增采用的引物的序列如seq?id?no.8，seq?id?no.9所示。

18、優(yōu)選的，

19、所述s5中px459-timd4質(zhì)粒的驗(yàn)證引物序列如seq?id?no.11，seq?id?no.12所示。

20、優(yōu)選的，

21、s4中所述左、右同源臂和啟動(dòng)子質(zhì)量比為1:1:2；所述同源臂片段與donor線性骨架通過gibson連接，所述同源臂片段和donor線性骨架質(zhì)量比為2:1。

22、根據(jù)上述方法構(gòu)建的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞。

23、根據(jù)上述方法構(gòu)建的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞在構(gòu)建炎癥反應(yīng)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

24、優(yōu)選的，

25、構(gòu)建炎癥反應(yīng)動(dòng)物模型的步驟為：

26、將野生型山羊乳腺上皮細(xì)胞、基因過表達(dá)乳腺上皮細(xì)胞復(fù)蘇后，細(xì)胞匯合度達(dá)70％～80％時(shí)，加10μg/ml?lps處理12h，提取細(xì)胞總mrna，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)炎癥因子基因的表達(dá)量。

27、優(yōu)選的，

28、所述炎癥因子pcr檢測(cè)引物序列如seq?id?no.13～seq?id?no.22所示。本發(fā)明的有益效果是：

29、本發(fā)明利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，以山羊原代乳腺上皮細(xì)胞為材料，將編碼timd4基因的啟動(dòng)子替換為內(nèi)源性強(qiáng)表達(dá)b-actin基因的啟動(dòng)子，將timd4基因過表達(dá)獲得了穩(wěn)定過表達(dá)山羊timd4基因的原代乳腺上皮細(xì)胞。本方法提供了一種構(gòu)建timd4基因過表達(dá)的方法，利用該方法得到的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞，可有效保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞免受lps誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，為乳腺炎基因治療領(lǐng)域提供理論支持。

技術(shù)特征：

1.timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，

7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞在構(gòu)建炎癥反應(yīng)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供Timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞的構(gòu)建方法及應(yīng)用，靶向山羊乳腺上皮細(xì)胞Timd4基因的gRNA，構(gòu)建Timd4基因過表達(dá)山羊乳腺上皮細(xì)胞。該方法包括：利用基因編輯技術(shù)，將編碼Timd4基因的啟動(dòng)子替換為內(nèi)源性強(qiáng)表達(dá)b?actin基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明設(shè)計(jì)了特異靶向Timd4基因的gRNA，利用Cas9蛋白向Timd4基因的5’UTR前插入內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子，從而達(dá)到對(duì)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行基因過表達(dá)的目的。利用本發(fā)明方法得到的Timd4基因過表達(dá)的山羊乳腺上皮細(xì)胞，可有效保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞免受LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本方法提供了一種構(gòu)建Timd4過表達(dá)的方法，為乳腺炎基因治療領(lǐng)域提供理論支持。

技術(shù)研發(fā)人員：邢怡明,白伊麗娜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10