本發(fā)明涉及基因工程，具體而言，涉及一種谷氨酸脫氫酶突變體及其在合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、草銨膦(2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸)是許多商業(yè)化除草劑的活性成分，是世界第二大轉(zhuǎn)基因作物耐受除草劑，其有兩種光學(xué)異構(gòu)體，分別為l-草銨膦及d-草銨膦，僅有l(wèi)-草銨膦具有除草活性。

2、l-草銨膦(即l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸)的制備方法主要有化學(xué)合成法及生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成法存在反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)步驟長、產(chǎn)物ee值(對映體過剩率，即enantiomeric?excess)低、收率低等問題，逐漸被取代。生物轉(zhuǎn)化法具備特異性高、綠色環(huán)保、反應(yīng)條件溫和及產(chǎn)物分離純化等優(yōu)點，目前已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。

3、目前，現(xiàn)有技術(shù)報道多條l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸的生物法合成路線，例如，中國專利cn110343676a對源于croynebacterium?glutamicum的谷氨酸脫氫酶進行定點突變，與野生型酶相比，獲得的突變體能夠催化更高濃度的底物，酶的作用效率有明顯提高。

4、盡管現(xiàn)有技術(shù)中的l-谷氨酸脫氫酶活性有明顯提高，但是其選擇的l-谷氨酸脫氫酶均為nadph依賴型，nadph價格昂貴，且需要添加葡萄糖脫氫酶及輔助底物葡萄糖，實現(xiàn)nadph的循環(huán)再生，生成副產(chǎn)物葡萄糖酸，這增加了原料成本及產(chǎn)物分離純化的難度，因此，選擇一種副產(chǎn)物易分離、原料成本低的l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦酰基]丁酸制備方法迫在眉睫。

5、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種谷氨酸脫氫酶突變體及其在合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸中的應(yīng)用，該谷氨酸脫氫酶突變體能夠提高其轉(zhuǎn)化ppo制備l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦酰基]丁酸的效率，并將其與甲酸脫氫酶(fdh)偶聯(lián)，實現(xiàn)輔酶nadh的循環(huán)再生。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

3、本發(fā)明合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸的路線如圖1所示，其以ppo為底物，在谷氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸。為了提高l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸的合成效率，本發(fā)明對nadh依賴型的谷氨酸脫氫酶進行定點突變，然后將其與甲酸脫氫酶偶聯(lián)，實現(xiàn)nadh的循環(huán)再生，提高ppo轉(zhuǎn)化為l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸的效率。

4、本發(fā)明的谷氨酸脫氫酶突變體是在seq?id?no.5所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上定點突變獲得。具體地，谷氨酸脫氫酶突變體的突變位點包括第322位、第378位、第346位、第92位和第165位中的至少一種。

5、其中，第322位的突變方式為：谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼帷⑻於０?、天冬氨酸或丙氨酸中的任意一種，即q322e、q322n、q322d和q322a。

6、第378位的突變方式為：絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸或天冬氨酸中的任意一種，即s378t、s378a、s378v、s378e和s378d。

7、第346位的突變方式為：天冬酰胺突變?yōu)楸彼?、絲氨酸或蘇氨酸中的任意一種，即n346a、n346s和n346t。

8、第92位的突變方式為：精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?、脯氨酸、絲氨酸或酪氨酸中的任意一種，即r92k、r92p、r92s和r92y。

9、第165位的突變方式為：異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸、亮氨酸或絲氨酸中的任意一種，即i165v、i165l和i165s。

10、上述第322位、第378位、第346位、第92和第165位的突變能夠提高l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸的合成效率，較佳地，谷氨酸脫氫酶突變體的突變方式為q322n、s378d、n346s、r92k和i165l中的任意一種或幾種的組合。

11、經(jīng)過試驗證明，當(dāng)谷氨酸脫氫酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.7所示時，其轉(zhuǎn)化效果最佳。如seq?id?no.7所示的氨基酸序列是在seq?id?no.5所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進行了q322n、s378d、n346s、r92k和i165l五點突變。

12、根據(jù)上述谷氨酸脫氫酶突變體可以獲得相關(guān)的生物材料，其包括：編碼上述谷氨酸脫氫酶突變體的核酸分子；含有上述核酸分子的表達盒；含有上述核酸分子的重組載體、或含有上述表達盒的重組載體；含有上述核酸分子的重組菌、或含有上述表達盒的重組菌、或含有上述重組載體的重組菌。

13、在本發(fā)明中，編碼上述谷氨酸脫氫酶突變體的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。

14、將上述谷氨酸脫氫酶突變體與甲酸脫氫酶聯(lián)用，用于合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸。具體地，本發(fā)明提供的一種合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸的方法包括：將表達上述谷氨酸脫氫酶突變體的重組菌與表達甲酸脫氫酶的重組菌進行破碎，然后將其上清液加入轉(zhuǎn)化體系中反應(yīng)，獲得l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸。

15、在一些實施例中，甲酸脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no.9所示。

16、在一些實施例中，表達谷氨酸脫氫酶突變體的重組菌與甲酸脫氫酶的重組菌的宿主包括大腸桿菌。

17、在一些實施例中，上述轉(zhuǎn)化體系包括：2-氧代-4-(羥基甲基氧膦基)丁酸、甲酸銨、nad+和重組菌體。

18、在一些實施例中，上述轉(zhuǎn)化體系包括：2-氧代-4-(羥基甲基氧膦基)丁酸5-150g/l、甲酸銨2-60g/l、nad+0.02-0.2mm、表達谷氨酸脫氫酶突變體的重組菌1-20g/l，表達甲酸脫氫酶的重組菌1-20g/l。

19、在一些實施例中，反應(yīng)的條件為：ph為6.0-9.0，溫度為15-40℃，搖床轉(zhuǎn)速150-250rpm，反應(yīng)時間1-5h。

20、本發(fā)明具有以下有益效果：

21、本發(fā)明通過定點突變獲得了高活性nadh依賴型谷氨酸脫氫酶突變體，利用谷氨酸脫氫酶突變體與甲酸脫氫酶能夠催化底物ppo及甲酸銨合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸。通過上述方法能夠?qū)崿F(xiàn)nadh循環(huán)再生，生成的副產(chǎn)物二氧化碳易分離，降低了l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸分離純化的成本；而且本發(fā)明的合成方法在2h內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化獲得119.2g/l的l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦酰基]丁酸，轉(zhuǎn)化率高達99％，ee值>99％，優(yōu)于原始酶和其他突變酶的轉(zhuǎn)化效果，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種谷氨酸脫氫酶突變體，其特征在于，所述谷氨酸脫氫酶突變體是在seq?id?no.5所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上發(fā)生突變獲得的，所述谷氨酸脫氫酶突變體的突變位點包括：第322位、第378位、第346位、第92位和第165位中的至少一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶突變體，其特征在于，所述谷氨酸脫氫酶突變體的突變方式為如下(1)-(5)中的任意一種或幾種的組合：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的谷氨酸脫氫酶突變體，其特征在于，所述谷氨酸脫氫酶突變體的突變方式為如下(1)-(5)中的任意一種或幾種的組合：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的谷氨酸脫氫酶突變體，其特征在于，所述谷氨酸脫氫酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

5.與權(quán)利要求1-4任一項所述的谷氨酸脫氫酶突變體相關(guān)的生物材料，其特征在于，為以下(1)-(4)中的任意一種：

6.如權(quán)利要求1-4任一項所述的谷氨酸脫氫酶突變體或權(quán)利要求5所述的生物材料在合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸及其衍生物中的應(yīng)用。

7.一種合成l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦?；鵠丁酸的方法，其特征在于，包括：將表達權(quán)利要求1-4任一項所述的谷氨酸脫氫酶突變體的重組菌與表達甲酸脫氫酶的重組菌進行破碎，然后將其上清液加入轉(zhuǎn)化體系中反應(yīng)，獲得l-2-氨基-4-[羥基(甲基)-膦酰基]丁酸。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述甲酸脫氫酶的氨基酸序列如seq?idno.9所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，表達所述谷氨酸脫氫酶突變體的重組菌與甲酸脫氫酶的重組菌的宿主包括大腸桿菌。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體系包括：2-氧代-4-(羥基甲基氧膦基)丁酸、甲酸銨、nad+和重組菌體；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種谷氨酸脫氫酶突變體及其在合成L?2?氨基?4?[羥基(甲基)?膦酰基]丁酸中的應(yīng)用，其中谷氨酸脫氫酶突變體是在氨基酸序列SEQ?ID?NO.5所示谷氨酸脫氫酶的基礎(chǔ)上發(fā)生突變獲得的，突變位點包括：第322位、第378位、第346位、第92位和第165位中的至少一種。通過上述突變獲得的谷氨酸脫氫酶突變體與甲酸脫氫酶能夠催化底物PPO及甲酸銨合成L?2?氨基?4?[羥基(甲基)?膦?；鵠丁酸，并且能夠?qū)崿F(xiàn)NADH循環(huán)再生，生成的副產(chǎn)物二氧化碳易分離，降低了L?2?氨基?4?[羥基(甲基)?膦?；鵠丁酸分離純化的成本；本發(fā)明的合成方法具有較好的轉(zhuǎn)化效果，因此具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：陶福平,葉芳勝,秦勇,楊波
受保護的技術(shù)使用者：江西唯鉑萊生物制藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10