本申請涉及生物醫(yī)學(xué)，特別涉及一種融合蛋白、工程化免疫細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor?infiltrating?lymphocytes，tils)是由cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、γδt細(xì)胞以及固有淋巴細(xì)胞(innate?lymphocytes,ilcs)等組成的異質(zhì)性細(xì)胞群體。經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，cd3+t細(xì)胞成為最主要細(xì)胞群體(所占比例通常大于95％)。cd3+t細(xì)胞表面表達(dá)tcr受體，在介導(dǎo)癌變細(xì)胞的免疫殺傷中起關(guān)鍵作用。由于不同的tcr受體識別主要組織相容性復(fù)合物(major?histocompatibility?complex，mhc)分子所呈遞的不同抗原肽，從而賦予t細(xì)胞抗原特異性。因此，一旦針對某抗原特異性t細(xì)胞受到特定抗原刺激，這些細(xì)胞可通過釋放細(xì)胞毒素和受體介導(dǎo)機(jī)制等方式，以促進(jìn)靶細(xì)胞的程序性死亡。

2、與car-t(chimeric?antigen?receptor?t-cell)/tcr-t細(xì)胞治療產(chǎn)品不同的是，通常tils是通過識別腫瘤細(xì)胞所呈遞出來的腫瘤相關(guān)抗原，如新抗原(neoantigen)等，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，til療法可通過識別和靶向多種腫瘤相關(guān)抗原以達(dá)到抗腫瘤治療目的。

3、然而，由于受腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫抑制相關(guān)因素的調(diào)控作用，til高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子，如pd-1、ctla4、tim3、lag3、tigit等。同時，由于持續(xù)性地受到腫瘤相關(guān)抗原的刺激作用，til呈現(xiàn)出高度耗竭狀態(tài)，如高表達(dá)tox、id3等耗竭相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。即使將til分離，在體外進(jìn)行重新激活后，til的殺傷功能仍受到限制。因此，如何增強(qiáng)til的持續(xù)地抗腫瘤功能是亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本申請一個或者多個實(shí)施例提供一種融合蛋白、工程化免疫細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

2、本申請的一個或者多個實(shí)施例提供一種融合蛋白；

3、自胞外結(jié)構(gòu)域一端至胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域一端，所述融合蛋白包括il-12p40亞基和膜蛋白，所述膜蛋白用于將所述il-12p40亞基錨定在細(xì)胞膜上。

4、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述膜蛋白包括i型膜蛋白、ii型膜蛋白、多次跨膜蛋白和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,gpi)錨定蛋白中的一種或者多種。

5、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述膜蛋白具有以下至少一種蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域或者所述跨膜結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域：t細(xì)胞受體的α鏈、t細(xì)胞受體的β鏈、t細(xì)胞受體的ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd48、cd55、cd64、cd80、cd86、cd90、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、icos、gitr、cd40、baffr、hvem、slamf7、nkp80、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、tgfβrii、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、itgb7、tnfr2、dnam1、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、ly9、psgl1、cd100、slamf6、slam、blame、selplg、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、和nkg2c。

6、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述il-12p40亞基和所述膜蛋白直接或間接連接。

7、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述il-12p40亞基和所述膜蛋白通過柔性linker和/或鉸鏈區(qū)中的一個或者多個相連接。

8、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述鉸鏈區(qū)選自以下至少一種蛋白的鉸鏈區(qū)：igg1、igg4、igg4m、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos和cd154。

9、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述融合蛋白從胞外結(jié)構(gòu)域到胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域依次包括所述il-12p40亞基、所述柔性linker、所述鉸鏈區(qū)和所述膜蛋白。

10、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述融合蛋白的n端連接有信號肽或者內(nèi)在信號錨定序列片段。

11、本申請的一個或者多個實(shí)施例提供一種工程化免疫細(xì)胞，所述工程化免疫細(xì)胞過表達(dá)所述融合蛋白。

12、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述工程化免疫細(xì)胞包括car-t、tcr-t、til和car-nk中的一種或者多種。

13、本申請的一個或者多個實(shí)施例提供一種所述的工程化免疫細(xì)胞的制備方法，其包括如下步驟：

14、提供一種待改造免疫細(xì)胞，對所述待改造免疫細(xì)胞進(jìn)行改造使表達(dá)所述的融合蛋白，從而構(gòu)建工程化免疫細(xì)胞。

15、本申請的一個或者多個實(shí)施例提供一種核酸分子，其編碼上述的融合蛋白。

16、本申請的一個或者多個實(shí)施例提供一種載體，其包括所述的核酸分子。

17、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述載體包括慢病毒、γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和脂質(zhì)納米顆粒中的一種或者多種。

18、本申請的一個或者多個實(shí)施例提供一種所述的工程化免疫細(xì)胞、所述的核酸分子或者所述的載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

19、在本申請的一些實(shí)施方式中，所述抗腫瘤藥物預(yù)防或/和治療如下腫瘤：肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等實(shí)體腫瘤。

20、本申請的一個或者多個實(shí)施例提供一種藥物，其包括所述的工程化免疫細(xì)胞，以及藥學(xué)上可以接受的載體。

21、相對于傳統(tǒng)技術(shù)，本申請的有益效果包括：

22、本申請通過將il-12的p40亞基與具有錨定作用的膜蛋白相連，使得p40亞基通過膜蛋白錨定在免疫細(xì)胞(例如為til)的細(xì)胞膜表面，意外地達(dá)到增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖能力和抗腫瘤殺傷效果。同時，也提升了il-12用于抗腫瘤治療的安全性。

技術(shù)特征：

1.融合蛋白；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述膜蛋白包括i型膜蛋白、ii型膜蛋白、多次跨膜蛋白和糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白中的一種或者多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述膜蛋白具有以下至少一種蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域或者所述跨膜結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域：t細(xì)胞受體的α鏈、t細(xì)胞受體的β鏈、t細(xì)胞受體的ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd48、cd55、cd64、cd80、cd86、cd90、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、icos、gitr、cd40、baffr、hvem、slamf7、nkp80、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、tgfβrii、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、itgb7、tnfr2、dnam1、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、ly9、psgl1、cd100、slamf6、slam、blame、selplg、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、和nkg2c。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的融合蛋白，其中，所述il-12p40亞基和所述膜蛋白間接連接。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中，所述il-12p40亞基和所述膜蛋白通過柔性linker和/或鉸鏈區(qū)中的一個或者多個相連接。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其中，所述鉸鏈區(qū)選自以下至少一種蛋白的鉸鏈區(qū)：igg1、igg4、igg4m、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos和cd154。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白從胞外結(jié)構(gòu)域到胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域依次包括所述il-12p40亞基、所述柔性linker、所述鉸鏈區(qū)和所述膜蛋白。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至3和5至7中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的n端連接有信號肽或者內(nèi)在信號錨定序列片段。

9.工程化免疫細(xì)胞，其特征在于，所述工程化免疫細(xì)胞過表達(dá)權(quán)利要求1至8中任一項所述的融合蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的工程化免疫細(xì)胞，其中，所述工程化免疫細(xì)胞包括car-t、tcr-t、til和car-nk中的一種或者多種。

11.權(quán)利要求9至10中任一項所述的工程化免疫細(xì)胞的制備方法，其包括如下步驟：

12.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1至8中任一項所述的融合蛋白。

13.一種載體，其包括權(quán)利要求12所述的核酸分子。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的載體，其中，所述載體包括慢病毒、γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和脂質(zhì)納米顆粒中的一種或者多種。

15.權(quán)利要求9至10中任一項所述的工程化免疫細(xì)胞、權(quán)利要求12所述的核酸分子或者權(quán)利要求13至14中任一項所述的載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

16.根據(jù)權(quán)利要求15中所述的用途，其中，所述抗腫瘤藥物預(yù)防或/和治療如下腫瘤：肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤。

17.一種藥物，其包括權(quán)利要求9至10中任一項所述的工程化免疫細(xì)胞，以及藥學(xué)上可以接受的載體。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種融合蛋白、工程化免疫細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。自胞外結(jié)構(gòu)域至胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所述融合蛋白包括IL?12p40亞基和膜蛋白，所述膜蛋白用于將所述IL?12p40亞基錨定在細(xì)胞膜上。本申請通過將IL?12的p40亞基與具有錨定作用的膜蛋白相連，使得p40亞基通過膜蛋白錨定在免疫細(xì)胞(例如為TIL)的細(xì)胞膜表面，從而達(dá)到增強(qiáng)TIL的抗腫瘤殺傷效果，同時，也提升了IL?12用于抗腫瘤治療的安全性。

技術(shù)研發(fā)人員：劉明宇,盧永,劉秋燕,張曦,韓德平
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州百吉生物制藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10