本發(fā)明關(guān)于生物，尤其涉及mir-378a-5p在促進(jìn)初始化cd4+t細(xì)胞向th1方向分化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、棘球蚴病，又稱包蟲病，是由棘球絳蟲的幼蟲寄生在宿主體內(nèi)而引發(fā)的一種人畜共患寄生蟲病，主要發(fā)生在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)。當(dāng)棘球蚴感染宿主后，宿主將產(chǎn)生非常復(fù)雜的免疫應(yīng)答，包括體液免疫、細(xì)胞免疫及補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。其中，cd4+t細(xì)胞在棘球蚴與宿主的相互關(guān)系中發(fā)揮著重要的作用。在早期預(yù)防的研究中，基因工程疫苗的研究備受關(guān)注。

2、非編碼rna(ncrna)的發(fā)現(xiàn)對基因表達(dá)調(diào)控的研究產(chǎn)生了重大影響。雖然其缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，但它們可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能，參與各種生物學(xué)機(jī)制，包括生長、遷移、自噬、細(xì)胞凋亡和分化等。其中microrna是細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的一類長度為22個核苷酸左右的單鏈非編碼小rna分子，主要通過與其靶基因的3ˊ非翻譯區(qū)發(fā)生特異性的相互作用降解靶mrna或抑制其翻譯，從而阻斷靶蛋白質(zhì)的形成，進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控作用。近年來，越來越多的研究揭示了mirna參與多種疾病的發(fā)展，其中包括不同類型的癌癥、心臟病(如肥大和缺血)以及與精神障礙(如精神分裂癥或重度抑郁癥)相關(guān)聯(lián)的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，寄生蟲感染同樣可以引起宿主mirna的變化，進(jìn)而調(diào)控一系列宿主基因的表達(dá)，從而逃避宿主免疫防御。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供mir-378a-5p在促進(jìn)初始化cd4+t細(xì)胞向th1方向分化中的應(yīng)用。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)了mir-378a-5p能通過調(diào)節(jié)其靶基因braf進(jìn)而影響初始化cd4+t細(xì)胞的分化，為棘球蚴病的預(yù)防與治療提供了新的線索和理論依據(jù)。

2、為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供mir-378a-5p在促進(jìn)初始化cd4+t細(xì)胞向th1方向分化中的應(yīng)用。

4、本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球絳蟲重組蛋白p29(reg.p29)對小鼠和綿羊的抗包蟲免疫保護(hù)力分別為96.6％和94.5％。reg.p29可同時刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，reg.p29免疫可誘導(dǎo)高水平的抗reg.p29特異性抗體，抗體反應(yīng)在加強(qiáng)免疫后第2周達(dá)到峰值，并維持超過16周，同時，reg.p29可通過促進(jìn)初始cd4+t細(xì)胞向th1方向分化，產(chǎn)生大量ifn-γ等細(xì)胞因子清除病原體。本發(fā)明以reg.p29為切入點(diǎn)，構(gòu)建小鼠的包蟲感染模型和reg.p29免疫模型，采用二代測序技術(shù)，篩選出了reg.p29免疫前后以及包蟲感染前后小鼠免疫細(xì)胞中差異表達(dá)的microrna分子。測序結(jié)果顯示，與包蟲陽性感染組相比，具有較高保護(hù)力的reg.p29免疫組mmu-mir-378a-5p表達(dá)水平顯著升高。本發(fā)明利用靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測了mir-378a-5p可能調(diào)控的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)其靶基因?yàn)閎raf。通過qrt-pcr、western?blot和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，mir-378a-5p通過調(diào)節(jié)braf進(jìn)而影響初始化cd4+t細(xì)胞的分化，進(jìn)一步確定mir-378a-5p能夠促進(jìn)小鼠脾臟初始化cd4+t細(xì)胞向th1方向分化，抑制其向th2方向分化。

5、為了驗(yàn)證mir-378a-5p靶基因braf對初始化cd4+t細(xì)胞分化的影響，本發(fā)明還合成了靶基因braf的干擾小片段sirna-braf-1341，在初始化cd4+t細(xì)胞中轉(zhuǎn)染該干擾小片段后，qrt-pcr、western?blot和流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示th1型細(xì)胞因子ifn-γ表達(dá)明顯上升，而th2型細(xì)胞因子il-4明顯下降，而轉(zhuǎn)染braf過表達(dá)慢病毒后則得到了相反的結(jié)果，說明braf抑制小鼠脾臟初始cd4+t細(xì)胞向th1方向分化，促進(jìn)其向th2方向分化。

6、為了驗(yàn)證mir-378a-5p靶基因braf功能恢復(fù)，本發(fā)明在小鼠脾臟初始化cd4+t細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染mir-378a-5p和braf后通過qrt-pcr和流式細(xì)胞術(shù)檢測th1型細(xì)胞因子ifn-γ和th2型細(xì)胞因子il-4的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-378a-5p引起的促進(jìn)初始化cd4+t細(xì)胞向th1方向分化能夠被braf恢復(fù)。

7、由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到脾臟細(xì)胞，人體實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行，因此本實(shí)驗(yàn)在小鼠脾臟細(xì)胞中驗(yàn)證。mir-378a-5p的成熟體序列在鼠和人體中是一致的，因此本發(fā)明為臨床探討包蟲感染病人體內(nèi)免疫機(jī)制的變化提供了新的思路和方向，為棘球蚴病的診斷與防治提供了新的線索和理論依據(jù)。

8、結(jié)合第一方面，所述mir-378a-5p的核苷酸序列為cuccugacuccagguccugugu(如seq?id?no:1所示)。

9、本發(fā)明第二方面提供mir-378a-5p模擬物在制備棘球蚴病預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用。由于mir-378a-5p模擬物能夠提高mir-378a-5p在細(xì)胞中的表達(dá)量，而mir-378a-5p能夠促進(jìn)初始化cd4+t細(xì)胞向th1方向分化，激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮控制包蟲早期形成、生長、轉(zhuǎn)移和抗感染的作用，因此mir-378a-5p模擬物可用于棘球蚴病預(yù)防或治療藥物的制備。

10、結(jié)合第二方面，所述mir-378a-5p模擬物為雙鏈：

11、正義鏈序列為：cuccugacuccagguccugugu(如seq?id?no:2所示)；

12、反義鏈序列為：acaggaccuggagucaggaguu(如seq?id?no:3所示)。

13、本發(fā)明第三方面提供一種預(yù)防棘球蚴病的藥物，其活性成分包括mir-378a-5p模擬物。

14、結(jié)合第三方面，所述mir-378a-5p模擬物為雙鏈：

15、正義鏈序列為：cuccugacuccagguccugugu；

16、反義鏈序列為：acaggaccuggagucaggaguu。

17、結(jié)合第三方面，所述藥物的劑型為注射劑。

18、本發(fā)明第三方面提供一種治療棘球蚴病的藥物，其活性成分包括mir-378a-5p模擬物。

19、結(jié)合第四方面，所述mir-378a-5p模擬物為雙鏈：

20、正義鏈序列為：cuccugacuccagguccugugu；

21、反義鏈序列為：acaggaccuggagucaggaguu。

22、結(jié)合第四方面，所述藥物的劑型為注射劑。

23、本發(fā)明的有益效果在于：初始化cd4+t細(xì)胞的分化對于宿主抵御外來病原體有很大作用，對于棘球蚴病的預(yù)防和治療具有重要意義。本發(fā)明初次證實(shí)mir-378a-5p和braf在小鼠脾臟初始化cd4+t細(xì)胞分化過程中的作用以及mir-378a-5p和braf之間的靶向關(guān)系，并且通過挽救實(shí)驗(yàn)證明了靶基因braf可以恢復(fù)由mir-378a-5p引起的細(xì)胞分化，由此證明mir-378a-5p在小鼠脾臟初始化cd4+t細(xì)胞分化過程中的作用。本發(fā)明為棘球蚴病的預(yù)防與治療提供了新的線索和理論依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.mir-378a-5p在促進(jìn)初始化cd4+t細(xì)胞向th1方向分化中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述mir-378a-5p的核苷酸序列為cuccugacuccagguccugugu。

3.mir-378a-5p模擬物在制備棘球蚴病預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述mir-378a-5p模擬物為雙鏈：正義鏈序列為：cuccugacuccagguccugugu，反義鏈序列為：acaggaccuggagucaggaguu。

5.一種預(yù)防棘球蚴病的藥物，其特征在于，其活性成分包括mir-378a-5p模擬物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于，所述mir-378a-5p模擬物為雙鏈：正義鏈序列為：cuccugacuccagguccugugu，反義鏈序列為：acaggaccuggagucaggaguu。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的藥物，其特征在于，所述藥物的劑型為注射劑。

8.一種治療棘球蚴病的藥物，其特征在于，其活性成分包括mir-378a-5p模擬物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物，其特征在于，所述mir-378a-5p模擬物為雙鏈：正義鏈序列為：cuccugacuccagguccugugu，反義鏈序列為：acaggaccuggagucaggaguu。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的藥物，其特征在于，所述藥物的劑型為注射劑。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明關(guān)于細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及miR?378a?5p在促進(jìn)初始化CD4<supgt;+</supgt;T細(xì)胞向Th1方向分化中的應(yīng)用。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)了miR?378a?5p能通過調(diào)節(jié)其靶基因BRAF進(jìn)而影響初始化CD4<supgt;+</supgt;T細(xì)胞的分化，并驗(yàn)證了miR?378a?5p引起的促進(jìn)初始化CD4<supgt;+</supgt;T細(xì)胞向Th1方向分化能夠被BRAF恢復(fù)。因此，miR?378a?5p模擬物可用于促進(jìn)初始化CD4<supgt;+</supgt;T細(xì)胞向Th1方向分化，從而可以作為活性成分，用于制備于棘球蚴病預(yù)防和治療藥物。

技術(shù)研發(fā)人員：朱明星,趙巍,張婷婷,錢炳碩,穆虎,王川
受保護(hù)的技術(shù)使用者：寧夏醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10