本發(fā)明屬于微生物基因工程，具體涉及一種解淀粉芽胞桿菌體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、解淀粉芽胞桿菌作為一種典型的工業(yè)微生物，是生產(chǎn)多種生物制劑的優(yōu)勢細(xì)胞工廠。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，高效的細(xì)胞工廠成為研究人員的迫切需求，建立快速、高效的合成生物學(xué)工具也成為解淀粉芽胞桿菌的研究熱點(diǎn)。體外進(jìn)化技術(shù)如易錯pcr、dnashuffling可對dna序列進(jìn)行高效的突變進(jìn)化，被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌宿主系統(tǒng)。但體外進(jìn)化技術(shù)依賴宿主菌的高轉(zhuǎn)化效率，目前解淀粉芽孢桿菌轉(zhuǎn)化效率普遍較低，限制了體外進(jìn)化系統(tǒng)在解淀粉芽胞桿菌中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明基于新型crispr單堿基編輯技術(shù)，在解淀粉芽胞桿菌中構(gòu)建一種體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過編輯堿基(c→t)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)元件的序列突變從而構(gòu)建高質(zhì)量rbs突變體文庫，進(jìn)一步利用高效堿性蛋白酶(apre)奶粉平板篩選模型獲得蛋白酶發(fā)酵活性顯著提升的解淀粉芽胞桿菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明一方面保護(hù)一種解淀粉芽胞桿菌體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)，所述體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)是在解淀粉芽孢桿菌中融合表達(dá)cas9n蛋白和胞苷脫氨酶aid，進(jìn)一步在apre基因上游整合啟動子p43的rbs編輯模板xp43，還包括靶標(biāo)編輯模板的sgrna表達(dá)質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述aid基因序列如seq?id?no.1所示，所述編輯模板xp43的序列如seq?id?no.15所示，所述sgrna的序列如seq?id?no.26所示。

2、本發(fā)明另一方面保護(hù)一種含有體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)的解淀粉芽胞桿菌，其構(gòu)建方法包括如下步驟：

3、(1)在解淀粉芽胞桿菌hz-12中融合表達(dá)cas9n和胞苷脫氨酶aid，所述aid基因序列如seq?id?no.1所示，構(gòu)建的工程菌株命名為解淀粉芽胞桿菌hzc9a；

4、(2)設(shè)計(jì)啟動子p43的rbs編輯模板xp43，所述編輯模板xp43的序列如seq?idno.15所示，進(jìn)一步將所述xp43整合至解淀粉芽胞桿菌hzc9a的apre基因上游，調(diào)控apre基因的表達(dá)效果，成功整合編輯模板的工程菌株命名為hzcax；

5、(3)根據(jù)編輯模板xp43設(shè)計(jì)延長的sgrna，所述sgrna的序列如seq?id?no.26所示，將啟動子p43、sgrna、終止子tamyl無縫連接后形成的融合基因克隆到穿梭載體，得到延長sgrna表達(dá)質(zhì)粒；

6、(4)所述的sgrna表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入hzcax感受態(tài)細(xì)胞中，靶向編輯模板xp43進(jìn)行堿基編輯，產(chǎn)生遺傳多樣性。

7、本發(fā)明還保護(hù)高蛋白酶活性的解淀粉芽胞桿菌的構(gòu)建方法，將上述含有體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)的解淀粉芽胞桿菌經(jīng)連續(xù)多代培養(yǎng)，獲得突變體文庫，將突變文庫細(xì)胞稀釋涂布在脫脂奶粉平板上，根據(jù)菌落在平板上產(chǎn)生透明圈的大小，挑取高堿性蛋白酶活性的解淀粉芽胞桿菌，并進(jìn)行堿性蛋白酶活性檢測。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，篩選得到一株高堿性蛋白酶活性的解淀粉芽胞桿菌hzcax-r7，其堿性蛋白酶活性為70.05u/ml，較出發(fā)菌株hzc9a提高4.70倍，其rbs序列為ggagaaaa。

8、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

9、(1)基于單堿基編輯技術(shù)，首次構(gòu)建了解淀粉芽胞桿菌的體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)。

10、(2)首次發(fā)現(xiàn)基于體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)可顯著提高解淀粉芽胞桿菌堿性蛋白酶活性。

技術(shù)特征：

1.一種解淀粉芽胞桿菌體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)，其特征在于，所述體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)包括cas9n蛋白，胞苷脫氨酶aid，rbs編輯模板以及sgrna表達(dá)質(zhì)粒，所述rbs編輯模板序列如seq?idno.15所示，所述sgrna的序列如seq?id?no.26所示。

2.含有體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)的解淀粉芽胞桿菌的構(gòu)建方法，其特征在，包括以下步驟：

3.權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的含有體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)的解淀粉芽胞桿菌。

4.高堿性蛋白酶活性的解淀粉芽胞桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將權(quán)利要求3所述含有體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)的解淀粉芽胞桿菌經(jīng)連續(xù)多代培養(yǎng)，獲得突變體文庫，將突變文庫細(xì)胞稀釋涂布在脫脂奶粉平板上，根據(jù)菌落在平板上產(chǎn)生透明圈的大小，挑取高堿性蛋白酶活性的解淀粉芽胞桿菌，并進(jìn)行堿性蛋白酶活性檢測。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種解淀粉芽胞桿菌體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)及其應(yīng)用，所述的進(jìn)化系統(tǒng)是在解淀粉芽孢桿菌中融合表達(dá)Cas9n蛋白和胞苷脫氨酶AID，構(gòu)建sgRNA單質(zhì)粒系統(tǒng)的CBE堿基編輯器，以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步插入含GGGGGGGG編輯區(qū)域的進(jìn)化模板XP43，設(shè)計(jì)延長的sgRNA以拓寬編輯窗口，提升體內(nèi)進(jìn)化系統(tǒng)的效率。進(jìn)一步以堿性蛋白酶活性為篩選目標(biāo)，采用延長sgRNA啟動進(jìn)化程序進(jìn)行多代編輯富集篩選后得到能產(chǎn)生梯度酶活的系列菌株，其中RBS序列為GGAGAAAA的編輯菌株HZCAX?R7堿性蛋白酶活性最高，較出發(fā)菌株HZC9A提高4.70倍。

技術(shù)研發(fā)人員：魏雪團(tuán),姜聰,韓文元,馬紅偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9