本發(fā)明涉及基因工程和代謝工程，具體涉及利用乙二醇和葡萄糖產(chǎn)蘋果酸的工程菌及構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乙二醇是化學(xué)品生產(chǎn)的重要底物之一，也是一種可再生的碳源，隨著全球能源緊缺和氣候變化問題的日益嚴(yán)重，其受到關(guān)注，具有廣泛的前景。目前，微生物利用乙二醇作為唯一碳源的研究主要集中在通過代謝工程改造微生物，使其能夠有效地將乙二醇轉(zhuǎn)化為高附加值的化學(xué)品。迄今為止，已報道了兩種類型的乙二醇代謝。在有氧條件下，使用煙酰胺和o2將eg氧化為乙醛酸；在厭氧條件下，乙二醇通過乙醛轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a，進(jìn)一步進(jìn)入三羧酸(tca)循環(huán)。研究報道，通過微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建，已實現(xiàn)了將乙二醇轉(zhuǎn)化為異丙醇、3-羥基丙酸等重要化學(xué)品，這對于減少對化石燃料的依賴和降低環(huán)境污染具有重要意義。然而，乙二醇的微生物轉(zhuǎn)化受到乙酰輔酶a含量限制，且微生物轉(zhuǎn)化途徑碳損耗大，使得生物高值轉(zhuǎn)化過程原子經(jīng)濟(jì)性低。葡萄糖可通過糖酵解途徑生成乙酰輔酶a，與乙醛酸結(jié)合生成蘋果酸進(jìn)入tca循環(huán)，提高乙二醇的生物利用率，這對微生物有效利用乙二醇具有重要意義。

2、蘋果酸是一種重要的二羧酸，可作為許多增值產(chǎn)品的前體，包括食品、制藥和化學(xué)工業(yè)。目前，蘋果酸的生產(chǎn)方法主要有三種：(1)通過由石油衍生的苯或丁烷中獲得的馬來酸或延胡索酸的水合化學(xué)合成；(2)以富馬酸為底物的富馬酸酶轉(zhuǎn)化酶合成；(3)利用葡萄糖的微生物發(fā)酵采用一種微生物的一步策略或兩種微生物的兩步策略。目前現(xiàn)有技術(shù)中尚無可利用乙二醇、葡萄糖作為共底物生產(chǎn)蘋果酸的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一目的在于提供利用乙二醇和葡萄糖產(chǎn)蘋果酸的工程菌。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一株利用乙二醇和葡萄糖產(chǎn)蘋果酸的工程菌，所述工程菌以大腸桿菌為宿主菌，宿主菌中檸檬酸合酶glta的內(nèi)源組成型啟動子替換為雙啟動子開關(guān)，并內(nèi)源過表達(dá)丙二醇氧化還原酶fuco基因和乙醛脫氫酶alda基因；

4、所述雙啟動子開關(guān)為lac啟動子系統(tǒng)和四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成的開關(guān)結(jié)構(gòu)；

5、所述lac啟動子系統(tǒng)的核苷酸序列如seq?id?no：1所示；所述四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

6、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述宿主菌選用大腸桿菌escherichia?colimg1655。

7、本發(fā)明的第二目的在于提供上述工程菌的構(gòu)建方法，包括：

8、將lac啟動子系統(tǒng)和四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)連入線性化載體pdonorcm(ptr)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pdonorcm(ptr)-placo1-tetr-pteto1；

9、構(gòu)建重組質(zhì)粒pqcascade(ptr)-glta1，其中g(shù)lta1為定位序列；

10、通過crispr相關(guān)轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pdonorcm(ptr)-placo1-tetr-pteto1、pqcascade(ptr)-glta1、ptns(ptr)至宿主菌株染色體，將glta的內(nèi)源組成型啟動子替換為雙啟動子開關(guān)，之后導(dǎo)入pcut消除質(zhì)粒，獲得含雙啟動子開關(guān)的菌株；

11、構(gòu)建含內(nèi)源性fuco、alda基因的重組質(zhì)粒并導(dǎo)入所述含雙啟動子開關(guān)的菌株，獲得所述工程菌。

12、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述定位序列從宿主菌的檸檬酸合酶基因前的序列中獲??；優(yōu)選宿主菌基因組中的檸檬酸合酶基因之前的32bp。

13、作為一種優(yōu)選的實施方式，以pet-29a(+)為載體質(zhì)粒，構(gòu)建含內(nèi)源性fuco、alda基因的重組質(zhì)粒。

14、作為一種優(yōu)選的實施方式，從宿主菌中pcr擴(kuò)增獲取fuco、alda基因片段，并在fuco、alda基因片段間通過引物攜帶方式插入rbs序列，之后轉(zhuǎn)化至載體質(zhì)粒pet-29a(+)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pet-29a(+)-fuco-rbs-alda。

15、作為一種優(yōu)選的實施方式，通過如下引物從宿主菌中pcr擴(kuò)增獲取fuco、alda基因片段：

16、fuco-f?5’-ggctgatatcggatccgaattcatggctaacagaatgatt-3’(ecori酶切位點)fuco-r?5’-gaacgggtactgacattatatctccttttaccaggcgg-3’

17、alda-f?5’-accataccgcctggtaaaaggagatataatgtcagtacccgttc-3’

18、alda-r?5’-ggtggtggtggtgctcgagagactgtaaataaaccac-3’(xhoi酶切位點)

19、本發(fā)明的第三目的在于提供上述工程菌在產(chǎn)蘋果酸中的應(yīng)用。

20、作為一種優(yōu)選的實施方式，以乙二醇和葡萄糖作為底物發(fā)酵所述工程菌，在發(fā)酵預(yù)設(shè)時間后加入iptg。

21、作為一種優(yōu)選的實施方式，在發(fā)酵9h后加入iptg。在發(fā)酵任意時間后加入iptg均可以起到開關(guān)效果，但在發(fā)酵9h后加入iptg，開關(guān)效果最優(yōu)，產(chǎn)量最高。

22、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述iptg添加濃度為0.05-0.5mm。

23、本發(fā)明具有如下有益效果：

24、(1)本發(fā)明利用基因工程及代謝工程手段，通過crispr基因編輯在大腸桿菌基因組中插入雙啟動子代謝開關(guān)placo1-tetr-pteto1，調(diào)控菌株代謝通路，使工程菌的中心代謝途徑向合成途徑的代謝通量可定向轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步過表達(dá)來源于宿主菌的內(nèi)源性基因fuco和alda，實現(xiàn)乙二醇利用進(jìn)入tca循環(huán)，獲得了一株可利用乙二醇-葡萄糖作為共碳源生產(chǎn)蘋果酸的大腸桿菌重組菌株，實現(xiàn)了重組大腸桿菌的乙二醇-葡萄糖共利用，并積累生產(chǎn)蘋果酸。

25、(2)本發(fā)明為含乙二醇的廢棄碳資源，如聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)尤其是滌棉解聚物的高值轉(zhuǎn)化提供新的路線，也為蘋果酸的生物合成提供廉價原料。對微生物發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸具有現(xiàn)實意義和指導(dǎo)價值。

技術(shù)特征：

1.一株利用乙二醇和葡萄糖產(chǎn)蘋果酸的工程菌，其特征在于：

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述宿主菌選用大腸桿菌escherichia?coli?mg1655。

3.權(quán)利要求1~2任一項所述工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述定位序列從宿主菌的檸檬酸合酶基因前的序列中獲??；優(yōu)選宿主菌基因組中，檸檬酸合酶基因之前的32bp。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，以pet-29a(+)為載體質(zhì)粒，構(gòu)建含內(nèi)源性fuco、alda基因的重組質(zhì)粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，從宿主菌中pcr擴(kuò)增獲取fuco、alda基因片段，并在fuco、alda基因片段間通過引物攜帶方式插入rbs序列，之后轉(zhuǎn)化至載體質(zhì)粒pet-29a(+)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pet-29a(+)-fuco-rbs-alda。

7.權(quán)利要求1~2任一項所述工程菌在產(chǎn)蘋果酸中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，以乙二醇和葡萄糖作為底物發(fā)酵所述工程菌，在發(fā)酵預(yù)設(shè)時間后加入iptg。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，在發(fā)酵9h后加入iptg。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述iptg添加濃度為0.05-0.5mm。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了利用乙二醇和葡萄糖產(chǎn)蘋果酸的工程菌及構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述工程菌以大腸桿菌為宿主菌，宿主菌中檸檬酸合酶gltA的內(nèi)源組成型啟動子替換為雙啟動子開關(guān)，并內(nèi)源過表達(dá)丙二醇氧化還原酶fucO基因和乙醛脫氫酶aldA基因；所述雙啟動子開關(guān)為lac啟動子系統(tǒng)和四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成的開關(guān)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明構(gòu)建了一個代謝切換開關(guān)，實現(xiàn)大腸桿菌的中心代謝途徑向合成途徑的代謝通量重定轉(zhuǎn)變，使得大腸桿菌工程菌可以實現(xiàn)共利用乙二醇與葡萄糖，并積累產(chǎn)生蘋果酸。該路線為含乙二醇的廢棄碳資源，如聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）尤其是滌棉解聚物的高值轉(zhuǎn)化提供新的路線，也為蘋果酸的生物合成提供廉價原料。

技術(shù)研發(fā)人員：錢秀娟,董維亮,林豪紅,姜岷,徐安明
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10