本發(fā)明涉及外泌體制備，具體涉及一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法及培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、外泌體是一種大小從30nm到150nm不等的細胞外囊泡。外泌體的主要作用通常被認為是作為細胞間通訊的載體，越來越多的研究認為外泌體是調(diào)節(jié)生理和病理條件下的生化反應(yīng)和細胞活性的關(guān)鍵介質(zhì)。目前相關(guān)臨床前研究和臨床開發(fā)需要用到大量外泌體，目前普遍是通過間充質(zhì)干細胞分泌來獲得外泌體，由于間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)周期長、成本高且外泌體產(chǎn)量低，這嚴重阻礙了外泌體的應(yīng)用，因此提高間充質(zhì)干細胞分泌外泌體的產(chǎn)量至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提出一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，通過將磷酸肌醇激酶的sirna(pikfyve-2)導(dǎo)入至間充質(zhì)干細胞中，能夠顯著提高間充質(zhì)干細胞外泌體的分泌量，解決了目前間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量低的問題。

2、本發(fā)明的另一目的在于提出一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的培養(yǎng)基，通過在培養(yǎng)基中添加磷酸肌醇激酶的sirna(pikfyve-2)，能夠提高外泌體的分泌量。

3、為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：將磷酸肌醇激酶的sirna導(dǎo)入至間充質(zhì)干細胞中，然后在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；

5、所述磷酸肌醇激酶的sirna的核苷酸序列如下：

6、5’-gagaugaguaugcgcugua-3’。

7、優(yōu)選地，所述提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法包括如下步驟：

8、(1)將轉(zhuǎn)染試劑和磷酸肌醇激酶的sirna進行混合，得到轉(zhuǎn)染復(fù)合液；

9、(2)將第4次傳代20～30h后的間充質(zhì)干細胞加入至干細胞培養(yǎng)基中，向干細胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液，轉(zhuǎn)染36～72h，使磷酸肌醇激酶的sirna導(dǎo)入至間充質(zhì)干細胞中；

10、(3)將步驟(2)轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24h。

11、優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)染復(fù)合液中所述磷酸肌醇激酶的sirna的質(zhì)量和所述轉(zhuǎn)染試劑的體積的比值為1：(3～5)。

12、優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)染復(fù)合液中所述磷酸肌醇激酶的sirna的質(zhì)量和所述轉(zhuǎn)染試劑的體積的比值為1：4。

13、優(yōu)選地，在步驟(2)中，向干細胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述干細胞培養(yǎng)基中所述磷酸肌醇激酶的sirna的濃度為20～30nm。

14、優(yōu)選地，在步驟(2)中，向干細胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述干細胞培養(yǎng)基中所述磷酸肌醇激酶的sirna的濃度為25nm。

15、優(yōu)選地，在步驟(2)sirna轉(zhuǎn)染之前，還包括間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和傳代步驟，間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和傳代步驟包括如下操作：

16、將間充質(zhì)干細胞接種至干細胞培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待間充質(zhì)干細胞融合率達到40％以上時進行傳代；

17、向培養(yǎng)瓶中加入消化液，放置于37℃消化2～3min后，加入完全培養(yǎng)基終止消化；將細胞懸液進行離心，結(jié)束后重懸在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

18、優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述干細胞培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。

19、一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以及添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的磷酸肌醇激酶的sirna；

20、所述磷酸肌醇激酶的sirna的核苷酸序列如下：

21、5’-gagaugaguaugcgcugua-3’。

22、優(yōu)選地，所述磷酸肌醇激酶的sirna在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為20～30nm。

23、本申請實施例提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果：

24、本技術(shù)方案通過將磷酸肌醇激酶的sirna(命名為pikfyve-2)導(dǎo)入至間充質(zhì)干細胞中，由于磷酸肌醇激酶(pikfyve)參與多種膜轉(zhuǎn)運過程，其特異性sirna對pikfyve的耗竭會增加間充質(zhì)干細胞外泌體的釋放，從而顯著提高間充質(zhì)干細胞外泌體的分泌量。同時，本技術(shù)方案通過在間充質(zhì)干細胞中轉(zhuǎn)染磷酸肌醇激酶的sirna，能縮短外泌體的生產(chǎn)周期，顯著降低外泌體的制備成本，且制備外泌體過程不需要昂貴的額儀器設(shè)備，對于外泌體的臨床前研究和臨床應(yīng)用具有很大的推動作用，適于推廣應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，將磷酸肌醇激酶的sirna導(dǎo)入至間充質(zhì)干細胞中，然后在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)染復(fù)合液中所述磷酸肌醇激酶的sirna的質(zhì)量和所述轉(zhuǎn)染試劑的體積的比值為1：(3～5)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)染復(fù)合液中所述磷酸肌醇激酶的sirna的質(zhì)量和所述轉(zhuǎn)染試劑的體積的比值為1：4。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，在步驟(2)中，向干細胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述干細胞培養(yǎng)基中所述磷酸肌醇激酶的sirna的濃度為20～30nm。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，在步驟(2)中，向干細胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述干細胞培養(yǎng)基中所述磷酸肌醇激酶的sirna的濃度為25nm。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，在步驟(2)sirna轉(zhuǎn)染之前，還包括間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和傳代步驟，間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和傳代步驟包括如下操作：

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述干細胞培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。

9.一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以及添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的磷酸肌醇激酶的sirna；

10.據(jù)權(quán)利要求9所述的提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的培養(yǎng)基，其特征在于，所述磷酸肌醇激酶的sirna在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為20～30nm。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法及培養(yǎng)基，涉及外泌體制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提高間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量的方法通過將磷酸肌醇激酶的siRNA(PIKfyve?2)導(dǎo)入至間充質(zhì)干細胞中，然后在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；磷酸肌醇激酶的siRNA的核苷酸序列如下：5’?GAGAUGAGUAUGCGCUGUA?3’。本發(fā)明的方法通過將磷酸肌醇激酶的siRNA(PIKfyve?2)導(dǎo)入至間充質(zhì)干細胞中，能夠顯著提高間充質(zhì)干細胞外泌體的分泌量，解決了目前間充質(zhì)干細胞外泌體產(chǎn)量低的問題。

技術(shù)研發(fā)人員：程放
受保護的技術(shù)使用者：佛山熱休生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10