本申請(qǐng)涉及生物，具體涉及一種fpg酶的制備方法及fpg酶的反應(yīng)體系。

背景技術(shù)：

1、fpg（甲酰胺嘧啶?[fapy]-dna?糖基化酶）也稱作8-氧代鳥(niǎo)嘌呤?dna?糖基化酶），是二代測(cè)序pe測(cè)序（paired-end，雙末端測(cè)序）非常重要的酶，這種酶能夠?qū)?-氧代-7,8-二氫鳥(niǎo)嘌呤（8-氧代鳥(niǎo)嘌呤，8-oxog）切割位點(diǎn)的引物進(jìn)行剪切，但此酶進(jìn)行標(biāo)簽純化時(shí)無(wú)活性或者活性低，因此，需要對(duì)fpg酶的表達(dá)體系和純化工藝進(jìn)行了研究，提升了酶的比活以及切割活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本申請(qǐng)一實(shí)施例有必要提供一種fpg酶的制備方法，該方法純化得到的酶的純度高，并具有高的酶活。

2、具體技術(shù)方案如下：

3、fpg酶的制備方法，該方法包括如下步驟：

4、制備含有fpg基因的無(wú)標(biāo)簽的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，制備重組菌；

5、誘導(dǎo)所述重組菌表達(dá)蛋白，收集菌體，裂解菌體，制備裂解后的樣品；

6、對(duì)所述的樣品進(jìn)行蛋白純化，制備fpg酶；

7、其中，所述樣品包括上清液蛋白和/或包涵體蛋白；

8、所述上清液蛋白進(jìn)行純化步驟包括：

9、用benzonase核酸酶處理所述樣品，離心收集上清液；

10、所述上清液經(jīng)硫酸銨沉淀，收集沉淀；

11、重懸所述沉淀，進(jìn)行疏水層析和陽(yáng)離子親和層析純化蛋白；

12、所述包涵體蛋白進(jìn)行純化包括如下步驟：

13、所述樣品經(jīng)離心，收集包涵體蛋白；

14、將所述包涵體蛋白進(jìn)行溶解和復(fù)性；

15、復(fù)性后的包涵體蛋白經(jīng)透析后進(jìn)行陽(yáng)離子親和層析純化蛋白。

16、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述疏水層析滿足如下條件中的至少一個(gè)：

17、采用hitrap?phenyl?hp層析柱；

18、用結(jié)合緩沖液b平衡柱子；

19、以1ml/min-3ml/min的流速進(jìn)行上樣；

20、用所述結(jié)合液b預(yù)洗脫除去雜蛋白；以及，

21、用結(jié)合緩沖液b與洗脫緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集線性洗脫樣品；

22、和/或，

23、所述陽(yáng)離子親和層析滿足如下條件中的至少一個(gè)：

24、采用hitrap?sp?sepharose?ff層析柱；

25、用結(jié)合緩沖液b平衡柱子；

26、以1ml/min-3ml/min的流速進(jìn)行上樣；

27、用所述結(jié)合緩沖液b預(yù)洗脫除去雜蛋白；以及，

28、用結(jié)合緩沖液b與洗脫緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集線性洗脫樣品；

29、其中，所述結(jié)合緩沖液b包括20mm-25mm?tris-hcl、50mm-55mm?nacl以及5%v/v-8%v/v甘油，ph值為7.2-7.6；

30、所述洗脫緩沖液包括20mm-25mm?tris-hcl、1m-2m?nacl以及5%v/v-8%v/v甘油，ph值為7.2-7.6。

31、在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述包涵體蛋白進(jìn)行溶解和復(fù)性的步驟包括如下：

32、所述包涵體蛋白經(jīng)洗滌緩沖液洗滌，離心，用溶解緩沖液溶解所得沉淀，處理3h-5h后低溫離心獲得可溶性包涵體蛋白；以及，

33、向所述可溶性包涵體蛋白中加入復(fù)性緩沖液，待所述可溶性包涵體蛋白復(fù)性后離心收集上清，透析；

34、其中，所述洗滌緩沖液包括20mm-25mm?tris-hcl、1m-2m?edta、2m-3?m尿素、1m-2mnacl、1%v/v-2%v/v?tritonx-100，ph8.0-8.5；

35、所述溶解緩沖液包括20mm-25mm?tris-hcl、100mm-105mm?nacl、5mm-6mm?dtt、8m-9m尿素、0.1%m/v-0.3%m/v?peg8000、50mm-55mm?l-arg以及5%v/v-8%v/v甘油，ph值為8.0-8.5；

36、所述復(fù)性緩沖液包括20mm-25mm?tris-hcl、100mm-120mm?nacl、0.1%m/v-0.3%m/vpeg8000、50mm-55mm?l-arg、5%v/v-8%v/v甘油，ph值為8.0-8.5。

37、所述的制備方法得到的fpg酶。

38、fpg酶的緩沖液，所述緩沖液包括以下工作濃度的組分：10mm-12mm?bis-tris-propane-hcl、10mm-12mm?mgcl2、1mm-2mm?dtt和100μg/ml-110μg/ml?recombinantalbumin，ph值為8.5-9.0。

39、fpg酶的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括2μm-5μm含8-氧代鳥(niǎo)嘌呤切割位點(diǎn)的核酸序列、10mm-12mm?bis-tris-propane-hcl、10mm-12mm?mgcl2、1mm-2mm?dtt、0.32u/μl-2u/μlfpg酶和100μg/ml-110μg/ml?recombinant?albumin。

40、相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)，本申請(qǐng)具備如下有益效果：

41、本申請(qǐng)對(duì)fpg酶的表達(dá)體系和純化工藝進(jìn)行了研究，通過(guò)無(wú)標(biāo)簽fpg酶表達(dá)純化工藝所得到的無(wú)標(biāo)簽fpg酶的純度高，且具有更高的酶活，并通過(guò)優(yōu)化fpg酶反應(yīng)體系來(lái)提升該酶對(duì)含8-氧代鳥(niǎo)嘌呤切割位點(diǎn)核酸的切割效率。

技術(shù)特征：

1.fpg酶的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，誘導(dǎo)所述重組菌表達(dá)蛋白的步驟包括將菌體培養(yǎng)至od600值為0.5-0.8，用iptg誘導(dǎo)表達(dá)；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述硫酸銨沉淀的步驟包括向所述上清液中加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨達(dá)到30%-70%飽和度，冷藏處理，離心獲得沉淀。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述硫酸銨沉淀為硫酸銨分級(jí)沉淀，其包括如下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4r任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，用結(jié)合緩沖液a重懸所述沉淀，制備上柱樣品，所述上柱樣品采用疏水層析進(jìn)行蛋白純化，經(jīng)透析后采用陽(yáng)離子親和層析進(jìn)行蛋白純化；其中，所述結(jié)合緩沖液a包括20mm-25mm?tris-hcl、2mm-3mm?nacl以及5%v/v-8%v/v甘油，ph值為7.2-7.6。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述疏水層析滿足如下條件中的至少一個(gè)：

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，將所述包涵體蛋白進(jìn)行溶解和復(fù)性的步驟包括如下：

8.fpg酶的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液包括以下工作濃度的組分：10mm-12mmbis-tris-propane-hcl、10mm-12mm?mgcl2、1mm-2mm?dtt和100μg/ml-110μg/mlrecombinant?albumin，ph值為8.5-9.0。

9.fpg酶的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系包括2μm-5μm含8-氧代鳥(niǎo)嘌呤切割位點(diǎn)的核酸序列、10mm-12mm?bis-tris-propane-hcl、10mm-12mm?mgcl2、1mm-2mm?dtt、0.32u/μl-2u/μl?fpg酶和100μg/ml-110μg/ml?recombinant?albumin。

10.fpg酶活的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括采用權(quán)利要求9所述的反應(yīng)體系進(jìn)行切割反應(yīng)；

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)涉及Fpg酶的制備方法及Fpg酶的反應(yīng)體系，該制備方法如下步驟：制備含有FPG基因的無(wú)標(biāo)簽的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，制備重組菌；誘導(dǎo)所述重組菌表達(dá)蛋白，收集菌體，裂解菌體，制備裂解后的樣品；對(duì)所述的樣品進(jìn)行蛋白純化，制備Fpg酶；其中，所述樣品包括上清液蛋白；所述上清液蛋白進(jìn)行純化步驟包括：用Benzonase核酸酶處理所述樣品，離心收集上清液；所述上清液經(jīng)硫酸銨沉淀，收集沉淀；重懸所述沉淀，進(jìn)行疏水層析和陽(yáng)離子親和層析純化蛋白。制備得到的酶活性高，且純度高。

技術(shù)研發(fā)人員：劉金枝,李漢東,鄒艷,劉鵬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳市大道測(cè)序生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10