本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、黃平黃牛是中國貴州省黔東南苗族侗族自治州黃平縣特有的優(yōu)良肉用牛品種，屬于當(dāng)?shù)氐牡胤叫詢?yōu)良牛種，體型較為粗壯，肌肉發(fā)達(dá)，肉質(zhì)細(xì)嫩，脂肪分布均勻，口感好，適合用于高檔的肉制品。黃平黃牛適應(yīng)性強(qiáng)，能夠適應(yīng)當(dāng)?shù)氐母吆絽^(qū)環(huán)境和粗糙的飼養(yǎng)條件，適合在貴州的山區(qū)地帶飼養(yǎng)，這利于當(dāng)?shù)卦黾咏?jīng)濟(jì)收益。
2、單核苷酸多態(tài)性(snp)是遺傳多樣性的主要來源，包括了基因組中的單個核苷酸變異，可以導(dǎo)致個體間存在基因型和表型上的差異。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的snps，根據(jù)它們在基因組中分布的位置可分為三類，包括基因編碼區(qū)snps、基因周邊snps和基因間snps。snps與很多表型經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)，對候選基因的snps進(jìn)行篩選并與相關(guān)生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以識別出對特定經(jīng)濟(jì)性狀有積極影響的snp基因型，從而為選育目標(biāo)優(yōu)良品種提供候選基因組學(xué)標(biāo)記，促進(jìn)優(yōu)良品種的選育和生產(chǎn)性能的提升。鑒定黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的snp位點，可以加快黃平黃牛良種選育速度。而用于探尋snp的方法，其中最常見的包括單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(sscp)、直接測序技術(shù)和pcr-rflp。sscp操作繁瑣、耗時長，結(jié)果受操作者主觀因素影響大，容易造成誤判。直接測序技術(shù)可以準(zhǔn)確地確定dna序列，尤其是在sanger測序中，每個堿基的順序都能被精確測定。可以用于測序小到幾百堿基的單個dna片段，也可以用于測序整個基因組，但是成本較高。
3、mc4r由下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌，是黑素皮質(zhì)素受體5個(mc1-5r)家族成員之一，其在哺乳動物中是一個調(diào)節(jié)體重和攝食行為的重要信號分子，可通過與其內(nèi)源性配體及拮抗劑相互作用一起調(diào)節(jié)食欲和能量代謝的作用，該基因也被認(rèn)為是家畜或家禽重要的生長性狀候選基因。人、豬、牛和羊等哺乳動物的mc4r由332個氨基酸殘基組成，具有7次跨膜結(jié)構(gòu)，是跨膜g蛋白耦聯(lián)受體家族的成員之一。因此，在該基因內(nèi)篩選出有利于黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的snp，通過對有利于增加體重和肉質(zhì)評分的基因型個體進(jìn)行有目的的選種選配，加快黃平黃牛良種選育速度，通過良種繁育和科學(xué)管理，促進(jìn)其良種的傳承和發(fā)展，保障了當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的可持續(xù)發(fā)展和當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的收入增加。但是，現(xiàn)有技術(shù)中黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因檢測存在周期長、不精確的問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)中黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因檢測周期長、不精確的問題，提供了檢測黃平黃牛的雙引物pcr擴(kuò)增體系，結(jié)果可靠，過程簡單。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法，包括以下步驟：
3、以黃平黃牛血液基因型dna為模板，以m1、m2為引物，pcr擴(kuò)增mc4r基因的一段序列，對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)凝膠電泳成像設(shè)備觀察擴(kuò)增結(jié)果、鑒定黃平黃牛mc4r基因上的snp位點的基因型；
4、所述的引物對m1為：
5、上游引物f：actatcttctatgcgctcca；
6、下游引物r：caccaagactgggcactg；
7、所述的引物對m2為：
8、上游引物f：gtcacaaacacctcgggaga；
9、下游引物r：gcctccgactaaagttgaag。
10、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。
11、優(yōu)選地，pcr反應(yīng)體系20μl：2×taqpcrmastermix10μl、上下游引物各1μl、基因組dna1μl，滅菌水8μl。
12、優(yōu)選地，所述瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1.0％。
13、優(yōu)選地，凝膠電泳成像設(shè)備中結(jié)果為，特異性地擴(kuò)增出735bp條帶時，判斷黃平黃牛為m1類，擴(kuò)增出455bp條帶時，判斷黃平黃牛為m2類。
14、優(yōu)選地，在15ml高壓滅菌的離心管(ep管)中加入1mledta溶液(10mg/ml)，用頸靜脈采血法采黃平黃牛血10ml注入管內(nèi)，上下顛倒使血液與acd抗凝劑充分混勻，其中acd抗凝和血液體積比6:1，在4℃條件下保存，得到冷藏血樣。
15、優(yōu)選地，所述的一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法在加快黃平黃牛良種選育速度中的應(yīng)用。
16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
17、本發(fā)明所設(shè)計出的檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的方法，通過設(shè)計引物m1、m2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)凝膠電泳成像設(shè)備觀察擴(kuò)增結(jié)果、確定位點基因型，從而能夠簡單快速檢測mc4r基因單核苷酸的多態(tài)性，同時克隆測序的連用，驗證測試結(jié)果，提高準(zhǔn)確度。該過程中，無需對擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切試驗，檢測時間較短，同時可繼續(xù)采用克隆測序進(jìn)一步驗證結(jié)果，結(jié)果可靠。檢測的snp位點可以作為候選分子標(biāo)記位點應(yīng)用于黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀分子標(biāo)記輔助選擇中，從而加快黃牛良種選育速度。
1.一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法，其特征在于，pcr反應(yīng)體系20μl：2×taqpcrmastermix10μl、上下游引物各1μl、基因組dna1μl，滅菌水8μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1.0％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法，其特征在于，凝膠電泳成像設(shè)備中結(jié)果為，特異性地擴(kuò)增出735bp條帶時，判斷黃平黃牛為m1類，擴(kuò)增出455bp條帶時，判斷黃平黃牛為m2類。
6.權(quán)利要求1-5中任意一項權(quán)利要求所述的一種檢測黃平黃牛優(yōu)良肉質(zhì)性狀基因的rna-seq方法在加快黃平黃牛良種選育速度中的應(yīng)用。