本發(fā)明涉及抗體工程領域，尤其涉及猴痘病毒人源單克隆抗體及其應用。

背景技術：

1、猴痘病毒(monkeypox?virus，mpxv)屬于痘病毒科(poxviridae)，脊椎動物痘病毒亞科(chordopoxvirinae)，正痘病毒屬(orthopoxvirus，opxv)。正痘病毒屬有10多個成員，其中包括天花病毒(varv)、牛痘(天花疫苗)病毒(vacv)、牛瘟病毒(cpxv)、駱駝痘病毒(cmlv)，以及自2010年以來從感染的人類或靈長類動物中分離的幾個新物種。根據vacv和mpxv之間的比較，痘病毒之間的表面蛋白表現(xiàn)出大約93-98％的序列相似性，暗示它們在進入機體過程中扮演類似的角色。

2、

3、猴痘是一種人畜共患病，其自然宿主還未明確，主要是在嚙齒類動物以及非人靈長類中傳播。可通過接觸皮膚受損組織等多種形式進行傳播。此外，近期猴痘病毒在非流行國家中的傳播呈現(xiàn)出與性接觸有關的現(xiàn)象，已經在精液等體液中發(fā)現(xiàn)了猴痘病毒的存在，但是否通過性接觸傳播還未明確。感染后會出現(xiàn)淋巴結腫大、肌肉酸痛以及膿包破裂后留下永久性瘢痕等癥狀。

4、自1980年消滅天花以及隨后人類停止接種天花疫苗，導致現(xiàn)在年輕群體對正痘病毒的免疫能力較低，可能是導致當前mpox爆發(fā)的原因之一。隨著多種猴痘病毒毒株在非流行國家中傳播，不僅傳播途徑多樣、隱蔽，感染癥狀非典型，而且猴痘病毒在人際傳播中還加速變異，其突變速率遠遠超出預期，對全球公共衛(wèi)生安全構成越來越大的威脅。雖然現(xiàn)在國內的猴痘病例并不多，但是隨著境內外人口流動，如何防治猴痘感染就成了亟待解決的關鍵問題。且目前尚無特定的抗病毒療法被批準用于治療人類mpxv感染。我們迫切地需要更多研究這種病毒來更好地預防與治療猴痘。

5、迄今為止，中和抗體已被證明是治療病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒和其它黃病毒等。mpxv存在胞外囊膜病毒(extracellular?envelopedvirus，eev)和胞內成熟病毒(intracellular?mature?virus，imv)粒子兩種形式。其中，a29l和e8l蛋白是imv表面的囊膜蛋白，在病毒感染過程中起關鍵作用。

6、已經有人成功制備了3種識別mpxv?a29l不同表位的單抗，9f8、3a1和2d1，它們均證實對正痘病毒具有較強的廣泛結合和中和活性，其中9f8的中和活性最好，同時對正痘病毒具有協(xié)同保護作用。也有人曾經表征了幾種人源抗d8抗體的結合特性，并解析了三種分別與d8結合的vacv-mab變體vacv-66、vacv-138和vacv304的晶體結構。

7、研發(fā)特異的、與抗原結合能力強、體外中和性好、親和力大、具有體內保護作用的新的猴痘病毒中和抗體是非常重要和必要的。

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明所要解決的問題：

2、針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明通過篩選全人抗體人源化小鼠抗a29l特異結合的記憶b細胞，獲得的人源高中和活性的mpxv抗體a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2，最終篩選出特異的、與猴痘病毒結合能力強、體外中和性好、親和力大新的猴痘病毒人源化單克隆抗體。

3、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體技術方案如下：

4、一、猴痘病毒a29l單克隆抗體的制備和純化

5、通過猴痘病毒a29l蛋白的表達與純化、與a29l蛋白結合的特異性記憶b細胞的分選、對猴痘病毒a29l抗體的表達及純化，獲得4種猴痘病毒a29l單克隆抗體，分別為a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2，這4種猴痘病毒單克隆抗體輕鏈與重鏈的氨基酸序列、輕鏈可變區(qū)cdr1-3、重鏈可變區(qū)cdr1-3如下，輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)跟已有序列都有不同，具有特異性。

6、二、單克隆抗體的性能驗證

7、(一)elisa檢測a29l抗原和抗體結合活性

8、a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2四種抗體均可以結合抗原，隨著抗體濃度增加結合活性增強，od450值增大。

9、(二)抗原和抗體中和試驗

10、通過空斑法檢測抗體的中和活性a29l抗體對vacv-wr的中和曲線結果，a29l-1a2、a29l-1a5、a29l-1b2、a29l-1b3的ic50分別為0.026、0.085、0.029、0.0411。

11、(三)表面等離子共振技術檢測抗體與抗原親和力

12、a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2四種抗體與抗原親和力較好。

13、(四)動物保護試驗

14、低劑量病毒感染情況下，多次給予a29-1a2抗體可對猴痘病毒感染小鼠提供保護。

15、與現(xiàn)有技術相比，本申請的有益效果在于：

16、本發(fā)明的人源化單克隆抗體抗體與猴痘病毒結合能力強、體外中和性好、親和力大、具有體內保護作用，與已經報道的猴痘病毒抗體序列完全不同，為猴痘病毒的檢測、中和提供了產品，為提供具有體內保護作用的猴痘病毒產品提供了可能。

技術特征：

1.一種中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3輕鏈cdr1的氨基酸序列為seq?id?no:1所示，輕鏈cdr2的氨基酸序列為seq?id?no:2所示，輕鏈cdr3的氨基酸序列為seq?id?no:3所示；

2.如權利要求1所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的輕鏈氨基酸序列如seq?id?no:7所示，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的重鏈氨基酸序列如seq?id?no:8所示。

3.如權利要求1所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3，其特征在于，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的輕鏈cdr1的核苷酸序列如seq?id?no:9所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的輕鏈cdr2的核苷酸序列如seqid?no:10所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的輕鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:11所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的重鏈cdr1的核苷酸序列如seq?id?no:12所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的重鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:13所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3的重鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:14所示。

4.如權利要求1所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3，其特征在于，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3輕鏈的核苷酸序列如seq?id?no:15所示，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3重鏈的核苷酸序列如seq?id?no:16所示。

5.如權利要求1-4任意一項所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b3在制備檢測猴痘病毒的產品中的應用。

6.一種中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2輕鏈cdr1的氨基酸序列為seq?id?no:17所示，輕鏈cdr2的氨基酸序列為seq?id?no:18所示，輕鏈cdr3的氨基酸序列為seq?id?no:19所示；

7.如權利要求6所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的輕鏈氨基酸序列如seq?id?no:23所示，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的重鏈氨基酸序列如seq?id?no:24所示。

8.如權利要求6所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2，其特征在于，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的輕鏈cdr1的核苷酸序列如seq?id?no:25所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的輕鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:26所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的輕鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:27所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的重鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:28所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的重鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:29所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2的重鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:30所示。

9.如權利要求6所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2，其特征在于，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2輕鏈的核苷酸序列如seq?id?no:31所示，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2重鏈的核苷酸序列如seq?id?no:32所示。

10.如權利要求6-9任意一項所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1b2在制備檢測猴痘病毒的產品中的應用。

11.一種中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5輕鏈cdr1的氨基酸序列為seq?id?no:33所示，輕鏈cdr2的氨基酸序列為seq?id?no:34所示，輕鏈cdr3的氨基酸序列為seq?id?no:35所示；

12.如權利要求11所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的輕鏈氨基酸序列如seq?id?no:39所示，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的重鏈氨基酸序列如seq?id?no:40所示。

13.如權利要求11所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5，其特征在于，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的輕鏈cdr1的核苷酸序列如seq?id?no:41所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的輕鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:42所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的輕鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:43所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的重鏈cdr1的核苷酸序列如seq?id?no:44所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的重鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:45所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5的重鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:46所示。

14.如權利要求11所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5，其特征在于，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體e8l-7e7輕鏈的核苷酸序列如seq?id?no:47所示，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體e8l-7e7重鏈的核苷酸序列如seq?id?no:48所示。

15.如權利要求11-14任意一項所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a5在制備檢測猴痘病毒的產品中的應用。

16.一種中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2輕鏈cdr1的氨基酸序列為seq?id?no:49所示，輕鏈cdr2的氨基酸序列為seq?id?no:50所示，輕鏈cdr3的氨基酸序列為seq?id?no:51所示；

17.如權利要求16所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的輕鏈氨基酸序列如seq?id?no:55所示，所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的重鏈氨基酸序列如seq?id?no:56所示。

18.如權利要求16所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2，其特征在于，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的輕鏈cdr1的核苷酸序列如seq?id?no:57所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的輕鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:58所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的輕鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:59所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的重鏈cdr1的核苷酸序列如seq?id?no:60所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的重鏈cdr2的核苷酸序列如seq?id?no:61所示，編碼所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2的重鏈cdr3的核苷酸序列如seq?id?no:62所示。

19.如權利要求16所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2，其特征在于，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2輕鏈的核苷酸序列如seq?id?no:63所示，編輯所述中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2重鏈的核苷酸序列如seq?id?no:64所示。

20.如權利要求16-19任意一項所述的中和猴痘病毒的人源單克隆抗體a29l-1a2在制備檢測猴痘病毒的產品中的應用。

技術總結
本發(fā)明涉及猴痘病毒人源單克隆抗體及其應用，通過篩選全人抗體人源化小鼠抗A29L特異結合的記憶B細胞，獲得的人源高中和活性的猴痘病毒抗體A29L?1B3、A29L?1B2、A29L?1A5和A29L?1A2，具有與猴痘病毒結合能力強、體外中和性好、親和力大、具有體內保護作用的特點，與已經報道的猴痘病毒抗體序列完全不同，為猴痘病毒的檢測、中和提供了產品，為提供具有體內保護作用的猴痘病毒產品提供了可能。

技術研發(fā)人員：高福,李燕,王奇慧,雷蕾,劉雅文
受保護的技術使用者：中國科學院微生物研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/9/17