本發(fā)明屬于生物醫(yī)學，具體涉及serpinh1基因條件性點突變動物模型的構建方法。

背景技術：

1、骨質(zhì)疏松癥是以骨量減低，骨組織微結構損壞，導致骨強度下降，容易發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥是受遺傳和環(huán)境等多因素調(diào)控的復雜疾病，其關鍵發(fā)病機制是骨轉換失衡。骨轉換受多條信號通路的精密調(diào)控。近年來對罕見疾病的研究為常見骨骼疾病的發(fā)病機制和治療，提供了非常有益的研究線索。

2、成骨不全癥作為最常見的單基因遺傳性骨病，是研究骨質(zhì)疏松性骨折的天然疾病模型。基因工程動物模型的建立和應用極大促進了對人類疾病機理和治療的探索，對于生命科學和基礎醫(yī)學的發(fā)展具有里程碑式的意義。serpinh1雙等位基因全身敲除動物模型會出現(xiàn)胚胎致死的現(xiàn)象，而條件性基因突變的打靶策略不僅能避免全基因敲除引起的胚胎致死及表型復雜等問題，而且能夠精準地評估基因在特定組織和器官中的功能和調(diào)控作用。目前，未有serpinh1基因條件性突變的動物模型的報道。而人類serpinh1基因編碼的hsp47蛋白與大鼠及小鼠的hsp47蛋白同源性高達93％以上，提示大、小鼠等哺乳動物可作為serpinh1基因突變的理想研究對象。所以，亟需在與人類遺傳同源性高度相似的動物中構建成骨不全癥的疾病模型，以深入研究骨折高風險發(fā)生的遺傳學機制、建立以serpinh1基因調(diào)控骨轉換關鍵信號通路為靶點的診療新策略。另一方面，serpinh1基因除了在研究骨骼代謝的遺傳學調(diào)控方面具有重要價值外，其在腫瘤、自身免疫病及糖尿病等的發(fā)病中也具有關鍵作用，本發(fā)明提供的動物模型在上述疾病研究中也具有重要的潛在應用價值。

技術實現(xiàn)思路

1、為彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種serpinh1基因條件性點突變動物模型的構建方法和應用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

3、本發(fā)明的第一方面提供了一種用于serpinh1基因編輯的sgrna，所述sgrna的序列如seq?id?no:3-6所示。

4、進一步，所述sgrna還包括與sgrna相關的生物材料。

5、進一步，所述生物材料選自如下任一種：

6、(1)編碼所述sgrna的核酸分子；

7、(2)含有(1)所述核酸分子的表達盒；

8、(3)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表達盒的重組載體；

9、(4)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表達盒或(3)所述重組載體的重組微生物；

10、(5)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表達盒的轉基因動物細胞系；

11、(6)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表達盒的轉基因動物組織；

12、(7)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表達盒的轉基因動物器官。

13、本發(fā)明的第二方面提供了一種用于serpinh1基因編輯的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括本發(fā)明第一方面所述的sgrna。

14、本發(fā)明的第三方面提供了一種serpinh1基因條件性點突變動物模型的構建方法，所述方法包括改變正常動物的serpinh1基因，使serpinh1基因的第62位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

15、進一步，所述方法包括如下步驟：

16、s1.體外轉錄sgrna；

17、s2.構建cas9打靶載體和donor載體；

18、s3.將cas9打靶載體、sgrna及donor載體導入到受體細胞，獲得f0代動物；

19、s4.測序驗證陽性的f0代動物交配獲得純合f1代serpinh1flox/flox動物，與cre動物雜交獲得serpinh1基因條件性點突變動物模型；

20、進一步，所述cre動物為cre哺乳動物。

21、進一步，所述cre哺乳動物為cre大鼠。

22、進一步，所述cre大鼠為bglap-cre大鼠。

23、進一步，所述bglap-cre大鼠構建所用的sgrna序列如seq?id?no:20-23所示。

24、進一步，步驟(1)中sgrna為本發(fā)明第一方面所述的sgrna。

25、進一步，所述動物為哺乳動物。

26、進一步，所述哺乳動物包括大鼠、小鼠。

27、進一步，所述哺乳動物選自大鼠。

28、進一步，所述大鼠為sd大鼠。

29、進一步，步驟(3)中的受體細胞為受精卵。

30、進一步，步驟(3)中的導入方式為顯微注射。

31、本發(fā)明的第四方面提供了本發(fā)明第二方面所述的系統(tǒng)在構建serpinh1基因條件性點突變模型中的應用。

32、進一步，所述的模型包括細胞模型、動物模型。

33、進一步，所述動物模型選自哺乳動物模型。

34、進一步，所述哺乳動物模型包括大鼠模型、小鼠模型。

35、進一步，所述大鼠模型為sd大鼠模型。

36、本發(fā)明第五方面提供了本發(fā)明第三方面所述的方法構建得到的serpinh1基因條件性點突變動物模型在篩選用于預防和/或治療成骨不全癥/骨質(zhì)疏松的候選藥物中的應用。

37、本發(fā)明的第六方面提供了本發(fā)明第一方面所述的sgrna的如下任一項應用：

38、(1)在構建serpinh1基因突變的模型中的應用；

39、(2)在研究成骨不全癥和/或骨質(zhì)疏松癥中的應用；

40、(3)在研究腫瘤疾病中的應用；

41、(4)在研究自身免疫疾病中的應用；

42、(5)在研究糖尿病中的應用。

43、進一步，(1)中所述的模型包括細胞模型、動物模型。

44、進一步，所述動物模型選自哺乳動物模型。

45、進一步，所述哺乳動物模型包括大鼠模型、小鼠模型。

46、進一步，所述大鼠模型為sd大鼠模型。

47、本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

48、本發(fā)明首次提供了serpinh1基因條件性點突變大鼠模型及其構建方法和應用。本發(fā)明方法構建的大鼠模型彌補了骨折高風險遺傳相關動物模型的不足，為研究骨折高風險的遺傳調(diào)控新機制提供了可靠、有效的實驗動物模型，為成骨不全癥、骨質(zhì)疏松癥預防、診斷以及治療新策略的建立提供了良好的動物基礎，具有重要的應用價值。此外，本發(fā)明在腫瘤、糖尿病及自身免疫性疾病等方面也具有潛在的應用價值。

技術特征：

1.一種用于serpinh1基因編輯的sgrna，其特征在于，所述sgrna的序列如seq?id?no:3-6所示。

2.根據(jù)權利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna還包括與sgrna相關的生物材料；

3.一種用于serpinh1基因編輯的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括權利要求1或2所述的sgrna。

4.一種serpinh1基因條件性點突變動物模型的構建方法，其特征在于，所述方法包括改變正常動物的serpinh1基因，使serpinh1基因的第62位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)中sgrna為權利要求1或2所述的sgrna。

7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述動物為哺乳動物；

8.權利要求3所述的系統(tǒng)在構建serpinh1基因條件性點突變模型中的應用；

9.權利要求4-6任一項所述的方法構建得到的serpinh1基因條件性點突變動物模型在篩選用于預防和/或治療成骨不全癥/骨質(zhì)疏松的候選藥物中的應用。

10.權利要求1或2所述的sgrna的如下任一項應用：

技術總結
本發(fā)明公開了SERPINH1基因條件性點突變動物模型的構建方法。本發(fā)明首次提供了SERPINH1基因條件性點突變大鼠模型及其構建方法和應用。本發(fā)明方法構建的大鼠模型彌補了骨折高風險遺傳相關動物模型的不足，為研究骨折高風險的遺傳調(diào)控新機制提供了可靠、有效的實驗動物模型，為成骨不全癥、骨質(zhì)疏松癥預防、診斷以及治療新策略的建立提供了良好的動物基礎，具有重要的應用價值。此外，本發(fā)明在腫瘤、糖尿病及自身免疫性疾病等方面也具有潛在的應用價值。

技術研發(fā)人員：李梅,林小云,胡靜
受保護的技術使用者：中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/10