本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種過表達(dá)cikpi基因及在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、柑橘炭疽病是一種世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重的真菌病害。在我國，柑橘炭疽病遍布各柑橘產(chǎn)區(qū)，是柑橘生產(chǎn)上的主要和常發(fā)性病害之一。春梢期和采果前期是柑橘炭疽病危害的嚴(yán)重時期。柑橘炭疽病菌危害春梢的幼葉和新梢，引起葉片和枝梢迅速萎蔫枯死，嚴(yán)重時可引起整株樹木枯死。柑橘炭疽病菌也危害花瓣和幼果，引起大量幼果脫落。果實開始轉(zhuǎn)色后，主要危害果梗，導(dǎo)致果梗干枯，果實提早脫落。采摘入庫的果實可能潛伏帶菌，在儲藏期引起炭疽病，果實自果蒂起腐爛。所以炭疽病又是一種重要的采后病害，對柑橘生產(chǎn)影響較大。

2、目前，柑橘炭疽病以化學(xué)防治為主。殺菌劑的連續(xù)使用，會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性從而降低化學(xué)防治效果。同時，也容易造成果實農(nóng)藥殘留，對人類健康和環(huán)境安全構(gòu)成潛在威脅。抗病基因的挖掘以及利用是防治柑橘炭疽病有效、經(jīng)濟(jì)、安全的措施。

3、kunitz型蛋白酶抑制劑(kpi)是植物在長期進(jìn)化過程中形成的一類抗性多肽，能夠抑制絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶與天冬氨酸蛋白酶的活性。研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白酶抑制劑與植物抗病具有重要的關(guān)系。wang等人首次發(fā)現(xiàn)太子參的kpi能夠抑制真菌fusariumoxysporum的生長(wang?and?ng，2006)。目前，利用kpi進(jìn)行抗病育種的研究較少，尚沒有利用kpi提高柑橘對炭疽病抗性的研究和應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)缺乏利用kpi提高柑橘對炭疽病抗性的研究和應(yīng)用的技術(shù)問題，目的在于提供一種過表達(dá)cikpi基因及在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，cikpi過表達(dá)能夠顯著減小柑橘真菌性炭疽病的病斑大小，減輕柑橘炭疽病的發(fā)病程度，炭疽病發(fā)病程度可最大降低至現(xiàn)有柑橘的48.8％。

2、本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個目的在于提供一種過表達(dá)cikpi基因，所述cikpi基因的編碼蛋白為胰蛋白酶抑制劑，所述cikpi基因具有如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。

4、本發(fā)明的第二個目的在于提供過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，包括以下應(yīng)用方法：

5、將cikpi基因?qū)敫涕偈荏w細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因柑橘植株。

6、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，cikpi基因過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因柑橘植株中的胰蛋白酶抑制劑的含量增加。

7、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，將cikpi基因?qū)胧荏w柑橘細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因柑橘植株具體包括：

8、克隆cikpi基因；

9、構(gòu)建cikpi過表達(dá)載體；

10、cikpi過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化柑橘，經(jīng)鑒定得到炭疽病抗性提高的轉(zhuǎn)基因柑橘植株。

11、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，克隆cikpi基因的方法包括：

12、提取柑橘總rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna作為模板，利用引物oe-cikpi-f和oe-cikpi-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增并回收目的基因dna片段；

13、引物oe-cikpi-f和oe-cikpi-r分別具有如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示的核苷酸序列。

14、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，cikpi過表達(dá)載體為plgne-cikpi。

15、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，cikpi過表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：

16、目的基因dna片段和plgne載體分別采用限制性內(nèi)切酶kpnⅰ和ecorⅰ雙酶切后連接，構(gòu)建過表達(dá)載體plgne-cikpi。

17、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，cikpi過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化柑橘的方法為：

18、cikpi過表達(dá)載體通過電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，再用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化柑橘外植體，遺傳轉(zhuǎn)化后從外植體傷口上長出的不定芽經(jīng)gus染色鑒定、嫁接、pcr鑒定、qrt-pcr分析cikpi表達(dá)量后得到轉(zhuǎn)基因柑橘植株。

19、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，pcr鑒定轉(zhuǎn)基因植株的引物為：gus-f和gus-r，分別具有如seq?id?no.4和seq?id?no.5所示的核苷酸序列。

20、作為本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案，qrt-pcr分析cikpi表達(dá)量的引物為：rt-cikpi-f和rt-cikpi-r，分別具有如seq?id?no.6和seq?id?no.7所示的核苷酸序列。

21、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：

22、1.本發(fā)明通過克隆柑橘cikpi基因，進(jìn)行過表達(dá)載體構(gòu)建，然后轉(zhuǎn)化柑橘，得到了柑橘的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株中的胰蛋白酶抑制劑的含量顯著增加，cikpi過表達(dá)能夠顯著減小柑橘真菌性炭疽病的病斑大小，減輕柑橘炭疽病的發(fā)病程度，炭疽病發(fā)病程度可最大降低至現(xiàn)有柑橘的48.8％。

23、2.本發(fā)明提供的cikpi基因可以獨立用作抗病分子育種，也可以與其他的抗病或感病基因一起進(jìn)行柑橘抗炭疽病分子育種，對柑橘抗炭疽病分子育種具有較大價值。

技術(shù)特征：

1.一種過表達(dá)cikpi基因，其特征在于，所述cikpi基因的編碼蛋白為胰蛋白酶抑制劑，所述cikpi基因具有如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。

2.如權(quán)利要求1所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，包括以下應(yīng)用方法：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，cikpi基因過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因柑橘植株中的胰蛋白酶抑制劑的含量增加。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，將cikpi基因?qū)胧荏w柑橘細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因柑橘植株具體包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，克隆cikpi基因的方法包括：

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，cikpi過表達(dá)載體為plgne-cikpi。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，cikpi過表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，cikpi過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化柑橘的方法為：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，pcr鑒定轉(zhuǎn)基因植株的引物為：gus-f和gus-r，分別具有如seq?id?no.4和seq?id?no.5所示的核苷酸序列。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的過表達(dá)cikpi基因在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，其特征在于，qrt-pcr分析cikpi表達(dá)量的引物為：rt-cikpi-f和rt-cikpi-r，分別具有如seq?idno.6和seq?id?no.7所示的核苷酸序列。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種過表達(dá)CiKPI基因及在提高柑橘炭疽病抗性的應(yīng)用，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，解決現(xiàn)有技術(shù)缺乏利用KPI提高柑橘對炭疽病抗性的研究和應(yīng)用的技術(shù)問題；所述CiKPI基因的編碼蛋白為胰蛋白酶抑制劑，所述CiKPI基因具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，通過克隆CiKPI基因，構(gòu)建CiKPI過表達(dá)載體，CiKPI過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化柑橘，經(jīng)鑒定得到炭疽病抗性提高的轉(zhuǎn)基因柑橘植株；本發(fā)明通過CiKPI基因過表達(dá)，能夠顯著減小柑橘真菌性炭疽病的病斑大小，減輕柑橘炭疽病的發(fā)病程度，炭疽病發(fā)病程度可最大降低至現(xiàn)有柑橘的48.8％。

技術(shù)研發(fā)人員：彭愛紅,朱玉龍,陳志毅,李強(qiáng),鄒修平,何永睿,陳善春
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西部（重慶）科學(xué)城種質(zhì)創(chuàng)制大科學(xué)中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10