本發(fā)明涉及植物基因工程，具體涉及一種直接誘導(dǎo)芽再生的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、再生是已經(jīng)分化的組織或細(xì)胞重新形成新組織的過程(birnbaum?and?sánchezalvarado，2008；ikeuchi?et?al.,2016；kareem?et?al.,2016；sugimoto?et?al.,2011；sugimoto?et?al.,2019)。高等植物可以通過組織修復(fù)、器官從頭再生或者體細(xì)胞胚胎發(fā)生三種方式進(jìn)行再生，其中，器官從頭再生是指從受傷或離體的植物組織上再生出不定根或者不定芽的過程，包括根從頭再生和芽從頭再生(shin?et?al.,2020)。

2、芽的再生是器官從頭再生的主要方式之一，涉及了大量細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變。研究發(fā)現(xiàn)，植物的芽再生可分為直接和間接兩種類型。在間接芽再生過程中，外植體先在富含生長(zhǎng)素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(callusinducing?medium)上誘導(dǎo)愈傷組織形成，然后轉(zhuǎn)到富含細(xì)胞分裂素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(shoot-inducing?medium)上誘導(dǎo)芽再生。而在直接芽再生過程中，側(cè)根原基(lateral?root?primordia)可以不經(jīng)過愈傷組織的產(chǎn)生直接轉(zhuǎn)分化為莖尖分生組織，此過程無愈傷組織產(chǎn)生。

3、對(duì)于直接芽再生和間接芽再生之間的調(diào)控機(jī)制，有研究以擬南芥幼苗的下胚軸和根作為外植體，依次在含有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得經(jīng)由愈傷組織間接芽再生和側(cè)根原基直接芽再生兩種體系在一個(gè)外植體上同時(shí)發(fā)生，利用報(bào)告株系的分析發(fā)現(xiàn)，wox5、wus、scr和arr1在兩種芽再生過程之間表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。wox11在兩種再生過程中存在差異，在芽的間接再生過程中，表達(dá)wox11的起始細(xì)胞數(shù)量較多，從而形成體積較大的莖尖分生組織；而在直接再生過程中，表達(dá)wox11的起始細(xì)胞數(shù)量較少，因而產(chǎn)生體積較小的莖尖分生組織。

4、wox(wuschel-related?homeobox)轉(zhuǎn)錄因子與植物發(fā)育密切相關(guān)，包括植物胚胎發(fā)育和體胚發(fā)生、花和根發(fā)育、愈傷組織的形成和維持，以及干細(xì)胞維持等過程。擬南芥有15個(gè)wox成員，不同wox轉(zhuǎn)錄因子具有表達(dá)模式的組織特異性和功能的特異性，其中，與其他wox轉(zhuǎn)錄因子不同的是，wox2的同源異形結(jié)構(gòu)域的下游還有1個(gè)假定的鋅指結(jié)構(gòu)域。而wox2與植物芽再生之間的關(guān)聯(lián)性還未見有報(bào)道。

5、目前，芽再生過程主要通過愈傷組織階段的間接芽再生來實(shí)現(xiàn)，整個(gè)過程培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，步驟較為繁瑣，因此，發(fā)掘高效的芽再生系統(tǒng)對(duì)于農(nóng)業(yè)推廣應(yīng)用非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種直接誘導(dǎo)芽再生的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)wox2基因能夠高效率的直接誘導(dǎo)芽再生，無需添加外源的植物激素，只需要在基本的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就能夠在轉(zhuǎn)基因植株的根上誘導(dǎo)形成芽，為植物的大規(guī)模無性繁殖提供了技術(shù)支持。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供wox2基因在誘導(dǎo)芽再生中的應(yīng)用；所述wox2基因是如下i)或ii)或iii)所示的dna分子：

4、i)核苷酸序列是seq?id?no.1所示的dna分子；

5、ii)除i)以外的編碼seq?id?no.2所示氨基酸序列的dna分子；

6、iii)與i)或ii)限定的dna片段具有90％或90％以上同一性，且編碼的蛋白在功能上與seq?id?no.2所示的蛋白等價(jià)的dna分子。

7、這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。同源性可以用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如可采用blast算法測(cè)定(altschul?et?al.1990.journal?of?molecularbiology?215:403-410；karlin?and?altschul.1993.proceedings?of?the?nationalacademy?of?sciences?90:5873-5877)。

8、上述核酸分子中，所述90％或90％以上同源性可以為至少90％、92％、93％、95％、96％、98％或99％的同源性。

9、上述應(yīng)用中，所述芽再生為直接芽再生。

10、本發(fā)明的第二方面，提供wox2基因編碼的蛋白在誘導(dǎo)芽再生中的應(yīng)用。

11、上述應(yīng)用中，所述wox2基因編碼的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

12、上述應(yīng)用中，所述芽再生為直接芽再生。

13、本發(fā)明的第三方面，提供含有wox2基因的重組表達(dá)載體或基因工程菌在誘導(dǎo)芽再生中的應(yīng)用。

14、上述應(yīng)用中，所述芽再生為直接芽再生。

15、上述應(yīng)用中，所述重組表達(dá)載體為含有wox2基因的per8載體。per8載體為雌激素誘導(dǎo)型表達(dá)載體，研究發(fā)現(xiàn)，與組成型表達(dá)載體相比，利用per8載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植株能夠顯著提高wox2基因的表達(dá)量。

16、本發(fā)明的第四方面，提供一種直接誘導(dǎo)芽再生的方法，包括以下步驟：

17、上調(diào)植物中wox2基因的表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株；收集轉(zhuǎn)基因植株的種子，對(duì)種子進(jìn)行萌發(fā)處理，將種子萌發(fā)后的幼苗在不含生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16天，在幼苗的根部長(zhǎng)出不定芽。

18、上述方法中，上調(diào)植物中wox2基因的表達(dá)是通過如下手段實(shí)現(xiàn)的：

19、外源轉(zhuǎn)入wox2基因；或者導(dǎo)入能夠激活或提高wox2基因的轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平或蛋白活性的dna片段。

20、上述方法中，對(duì)種子進(jìn)行萌發(fā)處理的方法包括：將消毒處理后的種子平鋪于含有10μmol/ml雌激素的1/2ms萌發(fā)培養(yǎng)基上，4℃春化處理3天打破休眠，春化結(jié)束后將種子在22℃進(jìn)行16h光照/8h黑暗培養(yǎng)。

21、上述方法中，所述不含生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基為含有10μmol/ml雌激素的1/2ms培養(yǎng)基。

22、本發(fā)明的第五方面，提供上述直接誘導(dǎo)芽再生的方法在如下(1)或(2)中的應(yīng)用：

23、(1)構(gòu)建芽再生的培養(yǎng)體系；

24、(2)規(guī)?；N苗生產(chǎn)。

25、本發(fā)明的有益效果：

26、本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)，wox2基因過量表達(dá)可以較高效率的直接誘導(dǎo)芽再生，無需添加外源的植物激素，只需要在基本的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就能夠在轉(zhuǎn)基因植株的根上誘導(dǎo)形成芽。該體系具有操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)程序簡(jiǎn)易、培養(yǎng)周期短、發(fā)生頻率高等優(yōu)勢(shì)，由于芽再生體系較為穩(wěn)定，可以在分子水平上研究其發(fā)生的分子機(jī)制。且對(duì)于與生產(chǎn)結(jié)合進(jìn)行規(guī)?；N苗生產(chǎn)也具有指導(dǎo)意義。

技術(shù)特征：

1.wox2基因在誘導(dǎo)芽再生中的應(yīng)用，其特征在于，所述wox2基因是如下i)或ii)或iii)所示的dna分子：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芽再生為直接芽再生。

3.wox2基因編碼的蛋白在誘導(dǎo)芽再生中的應(yīng)用，其特征在于，所述wox2基因編碼的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4.含有wox2基因的重組表達(dá)載體或基因工程菌在誘導(dǎo)芽再生中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為含有wox2基因的per8載體。

6.一種直接誘導(dǎo)芽再生的方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，上調(diào)植物中wox2基因的表達(dá)是通過如下手段實(shí)現(xiàn)的：

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，對(duì)種子進(jìn)行萌發(fā)處理的方法包括：將消毒處理后的種子平鋪于含有10μmol/ml雌激素的1/2ms萌發(fā)培養(yǎng)基上，4℃春化處理3天打破休眠，春化結(jié)束后將種子在22℃進(jìn)行16h光照/8h黑暗培養(yǎng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述不含生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基為含有10μmol/ml雌激素的1/2ms培養(yǎng)基。

10.權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的方法在如下(1)或(2)中的應(yīng)用：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種直接誘導(dǎo)芽再生的方法及其應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)，WOX2基因過量表達(dá)可以較高效率的直接誘導(dǎo)芽再生，無需添加外源的植物激素，只需要在基本的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就能夠在轉(zhuǎn)基因植株的根上誘導(dǎo)形成芽。該體系具有操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)程序簡(jiǎn)易、培養(yǎng)周期短、發(fā)生頻率高的優(yōu)勢(shì)，由于芽再生體系較為穩(wěn)定，可以在分子水平上研究其發(fā)生的分子機(jī)制。且對(duì)于與生產(chǎn)結(jié)合進(jìn)行規(guī)?；N苗生產(chǎn)也具有指導(dǎo)意義。

技術(shù)研發(fā)人員：張文杰,蘇英華,唐麗蘋,于洋,翟立明
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10