本發(fā)明涉及一種基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，屬于多肽的異源表達。

背景技術(shù)：

1、黃嘌呤氧化酶（xanthine?oxidase，xo）被認為是降尿酸的重要靶點，因此，高效地制備一些天然的xo抑制肽逐漸成為降尿酸領(lǐng)域的研究熱點。目前關(guān)于xo抑制肽定向制備的技術(shù)比較少，所以開發(fā)一種能定向且高效制備xo抑制肽的新技術(shù)仍是當(dāng)務(wù)之急。近年來，大腸桿菌（e.coli）因其遺傳背景清晰、表達水平高、穩(wěn)定性好、適用性廣，成為大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的理想宿主。然而，xo抑制肽作為小分子活性肽在微生物表達中易被降解或難表達，所以通過串聯(lián)短肽構(gòu)建小分子活性肽表達載體是解決該問題的有效途徑。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法。

2、本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、一種基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，包括以下步驟：

4、（1）重組表達載體的構(gòu)建：將xo抑制肽的編碼基因串聯(lián)形成n倍串聯(lián)體，得目的基因片段；然后將目的基因片段通過腸激酶位點與pet-30a（+）載體連接，得重組表達載體；

5、（2）重組菌株的構(gòu)建：將上述構(gòu)建的重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌，得表達目的基因的重組大腸桿菌；

6、（3）目的基因的表達：培養(yǎng)重組大腸桿菌并誘導(dǎo)表達目的基因，得發(fā)酵液；

7、（4）xo抑制肽的提取純化：發(fā)酵液離心得菌體沉淀，菌體沉淀重懸后超聲破碎，離心得粗蛋白液；粗蛋白液經(jīng)鎳柱親和層析純化，得重組蛋白；對重組蛋白進行腸激酶酶切和胰蛋白酶酶切，即得xo抑制肽。

8、進一步地，所述xo抑制肽為aeaqmwr或aeawmwr，其中，aeaqmwr記載在中國發(fā)明專利cn?115385986?a中；aeawmwr是對aeaqmwr進行優(yōu)化而得到的，其xo抑制活性已得到實驗驗證。aeaqmwr的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，aeawmwr的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

9、進一步地，所述n為2～15的整數(shù)，優(yōu)選10。

10、本發(fā)明的基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，首先串聯(lián)xo抑制肽aeaqmwr或aeawmwr的編碼基因作為目的基因，構(gòu)建重組表達載體，然后在大腸桿菌中進行異源表達；最后對重組蛋白進行純化和酶切，得到單體肽aeaqmwr或aeawmwr，單體肽aeaqmwr或aeawmwr具有預(yù)防高尿酸血癥的潛在價值。本發(fā)明首次成功構(gòu)建并表達了含有串聯(lián)體xo抑制肽的表達載體，從而實現(xiàn)了xo抑制肽的定向制備，提高了xo抑制肽的制備效率，為定向獲得新型生物活性肽提供了新的技術(shù)。

11、本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義。

技術(shù)特征：

1.一種基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，其特征在于：所述xo抑制肽為aeaqmwr。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，其特征在于：所述xo抑制肽為aeawmwr。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，其特征在于：所述n為2～15的整數(shù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于串聯(lián)體異源表達制備xo抑制肽的方法，其特征在于：所述n為10。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于串聯(lián)體異源表達制備XO抑制肽的方法，包括以下步驟：（1）將XO抑制肽的編碼基因串聯(lián)形成n倍串聯(lián)體，通過腸激酶位點與PET?30a（+）載體連接，得重組表達載體；所述XO抑制肽為AEAQMWR或AEAWMWR；（2）將重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌，得重組大腸桿菌；（3）培養(yǎng)重組大腸桿菌并誘導(dǎo)表達目的基因，得發(fā)酵液；（4）發(fā)酵液離心得菌體沉淀，菌體沉淀重懸后超聲破碎，離心得粗蛋白液；粗蛋白液經(jīng)鎳柱親和層析純化，得重組蛋白；對重組蛋白進行腸激酶酶切和胰蛋白酶酶切，即得XO抑制肽。本發(fā)明實現(xiàn)了XO抑制肽的定向制備，提高了XO抑制肽的制備效率。

技術(shù)研發(fā)人員：姜宏,毛相朝,毛振杰,王永臻
受保護的技術(shù)使用者：中國海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10