本發(fā)明屬于水生生物細胞和水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控，具體涉及一種大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、中華鱘(acipenser?sinensis)是我國長江中上游特有的一種大型淡水魚類，也是世界上保存至今最古老的淡水魚類之一。其隸屬于鱘形目、鱘科、鱘屬的軟骨硬鱗魚，在進化生物學上具有極其重要的位置，被視為活化石，具有重要的保護和研究價值。然而，由于人類生命活動，長江流域的生態(tài)環(huán)境受到了較為嚴重的破壞，導致了中華鱘的棲息地減少和數(shù)量銳減。20世紀后期，中華鱘野生群體自然產(chǎn)卵多次中斷，2017～2022年連續(xù)中斷，表明中華鱘自然種群衰退嚴重，生存狀況十分危急，保護中華鱘的種質(zhì)資源已成為刻不容緩的任務(wù)。

2、中華鱘種群資源的恢復依賴于人工增殖放流、繁育、以及苗種培育等。為了保證人工保種群體和放流群體的健康和穩(wěn)定，中華鱘病害防治是關(guān)鍵一環(huán)?，F(xiàn)有鯉春病毒血癥的病毒(svcv)、胰腺壞死病毒(ipnv)感染西伯利亞鱘和高首鱘的報道。此外，已有中華鱘尾鰭細胞系對蛙虹彩病毒敏感的報道，而在中華鱘的保育養(yǎng)殖過程中，常投喂大口黑鱸魚等鮮活餌料。大口黑鱸在夏季易感染虹彩病毒，該病毒是虹彩病毒科蛙病毒屬。由此，推測中華鱘群體可能感染具有其餌料魚大口黑鱸魚虹彩病毒(lmbv)的巨大風險。

3、為了保障中華鱘人工保種、繁育以及苗種培育等工作的中華鱘的機體健康，對其餌料魚病毒和中華鱘機體之間關(guān)系的研究是十分必要的。細胞系是病毒敏感性研究的基本材料，為深入餌料魚大口黑鱸魚虹彩病毒與中華鱘之間作用關(guān)系，亟待建立體外中華鱘細胞系。但要獲得對病毒敏感的細胞系，具有一定的偶然性和困難性；通常需要以數(shù)量對質(zhì)量，即制備大批量的原代細胞系，從中篩選出所需要的細胞系。中華鱘是瀕危動物，其樣本采集要在機體安全無風險的前提下，中華鱘的尾鰭具有一定的再生能力是較為理想的樣本。由此，如何建立一種對其餌料魚大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭來源的細胞系成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系，其分類命名為中華鱘尾鰭細胞系(acipenser?sinensis?caudal?fin?cellline，aswfine)，保藏在位于湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2024年7月11日，保藏編號為cctcc?no：c2024198。

2、本發(fā)明的中華鱘尾鰭細胞系aswfine對大口黑鱸魚虹彩病毒(lmbv)具有敏感性，感染后24小時，就可觀察到細胞脫落；采用針對大口黑鱸魚蛙虹彩病毒的主要衣殼蛋白(major?capsid?protein，mcp)設(shè)計的以下特異性引物可檢測到病毒增殖：

3、mcp-f:5'-tcaaagagcattatcccgt-3'(seq?id?no:1)；

4、mcp-r:5'-cccatggaaccgttcatgat-3'(seq?id?no:2)；

5、本發(fā)明細胞系為評估中華鱘餌料魚大口黑鱸魚虹彩病毒(lmbv)對中華鱘機體健康的影響搭建了必要的技術(shù)平臺，為中華鱘健康養(yǎng)殖和病害防控奠定了較為重要的基礎(chǔ)。

6、進一步地，所述中華鱘尾鰭細胞系aswfine的培養(yǎng)方法如下：

7、(1)組織預處理：取中華鱘尾鰭尖組織，置于含青霉素、鏈霉素的dmem細胞培養(yǎng)基，搖晃除去組織表面的雜菌和血細胞；

8、(2)組織處理：將處理好的鰭組織剪成組織塊，均勻移植到細胞培養(yǎng)瓶底部中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置15-30min，使組織塊能貼壁并在后續(xù)的培養(yǎng)處理過程中不易脫落；

9、(3)原代細胞培養(yǎng)：在組織塊貼壁良好的細胞培養(yǎng)瓶中，加入含20％胎牛血清和10％青霉素-鏈霉素雙抗的dmem培養(yǎng)液(本發(fā)明中培養(yǎng)液組分含量均為體積百分比)，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待到細胞從尾鰭組織邊緣遷出后，每隔一段時間更換培養(yǎng)液；

10、(4)傳代培養(yǎng)：當原代培養(yǎng)細胞長滿培養(yǎng)瓶底90％及以上時，棄去培養(yǎng)液，pbs清洗、胰蛋白酶消化后進行傳代培養(yǎng)；首次傳代采用1:2傳代，傳代培養(yǎng)至10代以后，將培養(yǎng)液中的胎牛血清含量降至10-15％，并進行后續(xù)的傳代培養(yǎng)。

11、進一步地，所述中華鱘尾鰭細胞系aswfine為成纖維細胞，是以波形蛋白和細胞角蛋白分別作為標記蛋白，采用免疫熒光法鑒定得到。

12、本發(fā)明的目的之二是提供中華鱘尾鰭細胞系aswfine的應(yīng)用，基于該細胞系具有感染lmbv病毒的能力，其可在多方面進行應(yīng)用，具體包括但不限于以下任一種：

13、a.在構(gòu)建大口黑鱸魚虹彩病毒感染模型中的應(yīng)用；

14、b.在大口黑鱸魚虹彩病毒培養(yǎng)和增殖中的應(yīng)用；

15、c.在分離大口黑鱸魚虹彩病毒中的應(yīng)用；

16、d.在制備檢測大口黑鱸魚虹彩病毒的試劑中的應(yīng)用；

17、e.在制備大口黑鱸魚虹彩病毒疫苗中的應(yīng)用；

18、f.在制備大口黑鱸魚虹彩病毒所致疾病的藥物中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明具有以下有益效果：

20、1、本發(fā)明首次評估了中華鱘的餌料魚大口黑鱸魚的虹彩病毒lmbv具有感染中華鱘的能力，為中華鱘的健康養(yǎng)殖和病害防控提供一定參考數(shù)據(jù)。

21、2、本發(fā)明中華鱘的尾鰭細胞系對大口黑鱸魚的虹彩病毒lmbv具有敏感性，接種病毒后，該細胞系可檢測到病毒增殖，可用于病原特性研究、基因組學研究以及相關(guān)疫苗的研制、水體毒性評價等方面的研究，具有廣闊的應(yīng)用前景。

22、3、本發(fā)明首次在鱘的細胞系上應(yīng)用人源的抗體波形蛋白(vimentin)和細胞角蛋白(cytokeratin)對中華鱘的尾鰭細胞類型進行了鑒定，明確了該細胞系為成纖維細胞，這為后續(xù)中華鱘魚相關(guān)細胞的鑒定奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系，其特征在于，分類命名為中華鱘尾鰭細胞系(acipenser?sinensis?caudal?fin?cell?line，aswfine)，于2024年7月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctcc?no：c2024198。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系，其特征在于，其培養(yǎng)方法如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系，其特征在于，該細胞系為成纖維細胞，是以波形蛋白和細胞角蛋白分別作為標記蛋白，采用免疫熒光法鑒定得到。

4.權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系在構(gòu)建大口黑鱸魚虹彩病毒感染模型中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系在大口黑鱸魚虹彩病毒培養(yǎng)和增殖中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系在大口黑鱸魚虹彩病毒培養(yǎng)和增殖中的應(yīng)用，其特征在于，所述中華鱘尾鰭細胞系感染大口黑鱸魚虹彩病毒后，采用序列如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示的特異性引物，可在細胞系中檢測到病毒增殖。

7.權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系在分離大口黑鱸魚虹彩病毒中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系在制備檢測大口黑鱸魚虹彩病毒的試劑中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系在制備大口黑鱸魚虹彩病毒疫苗中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求1所述的大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系在制備大口黑鱸魚虹彩病毒所致疾病的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于水生生物細胞和水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種大口黑鱸魚虹彩病毒敏感的中華鱘尾鰭細胞系及其應(yīng)用。該細胞系分類命名為中華鱘尾鰭細胞系(Acipenser?sinensis?caudal?fin?cell?line，AsWFine)，于2024年7月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：C2024198。本發(fā)明首次評估了中華鱘的餌料魚大口黑鱸魚的虹彩病毒具有感染中華鱘的能力，獲得了對大口黑鱸魚虹彩病毒具有敏感性的中華鱘尾鰭細胞系A(chǔ)sWFine，感染后24小時就可觀察到細胞脫落，采用特異性引物通過PCR擴增可檢測到病毒增殖，該細胞系可用于病原特性研究、基因組學研究以及相關(guān)疫苗的研制、水體毒性評價等方面的研究，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：黨慧鳳,鄭躍平,徐嘉楠,顧士連,范厚勇,黃文吉,邵玲
受保護的技術(shù)使用者：上海市水生野生動植物保護研究中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10