本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)，尤其涉及一種子囊霉素的制備方法。

背景技術(shù)：

1、子囊霉素(ascomycin，fk520)是一種23元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有免疫抑制和抗真菌活性。目前，子囊霉素及其衍生物作為免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用于抑制器官移植后的免疫排斥反應(yīng)。在治療多種自身免疫疾病諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡也發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，在抗真菌、治療瘧疾等方面也占有一席之地。子囊霉素首次發(fā)現(xiàn)是由日本藤澤制藥公司(fujisawa)在上世紀(jì)60年代從含有吸水鏈霉菌(streptomyces?hygroscopicus?no.kk317)的土壤中分離得到，其分子式為c43h67no12，易溶于甲醇、丙酮等。其具體結(jié)構(gòu)式如下：

2、

3、當(dāng)前大規(guī)模生產(chǎn)子囊霉素的方法依然是通過吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)的發(fā)酵實(shí)現(xiàn)。但是有關(guān)該發(fā)酵過程調(diào)控的相關(guān)研究較少，所以在實(shí)際生產(chǎn)中往往無法嚴(yán)格控制菌體生長(zhǎng)過程，造成最終的發(fā)酵水平難以掌控。此外，子囊霉素發(fā)酵過程中產(chǎn)生的相似組分去甲基子囊霉素(fk523)在后期提取純化中難以去除，導(dǎo)致生產(chǎn)成本進(jìn)一步增加。因此，這種低產(chǎn)量、后期提取純化復(fù)雜帶來的高成本發(fā)酵方法已成為制約子囊霉素大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種子囊霉素的制備方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)子囊霉素產(chǎn)生菌的菌絲形態(tài)進(jìn)行調(diào)控，使其生長(zhǎng)為最有利于產(chǎn)生子囊霉素的形態(tài)，最終不僅可以有效提高子囊霉素的產(chǎn)量，還能夠減少主要副產(chǎn)物fk523的比例。

2、本發(fā)明提供一種子囊霉素的制備方法，包括如下步驟：

3、步驟1、將子囊霉素產(chǎn)生菌的孢子接種至菌種活化培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)得到成熟孢子；

4、步驟2、將成熟孢子接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行第一培養(yǎng)，培養(yǎng)36-48h后向種子培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5-1.5mg/l的聚二甲基二烯丙基氯化銨進(jìn)行第二培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液；

5、步驟3、將種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行第三培養(yǎng)，至少培養(yǎng)12h后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5-2.0mg/l的聚二甲基二烯丙基氯化銨進(jìn)行第四培養(yǎng)得到子囊霉素。

6、如上所述的制備方法，其中，第一培養(yǎng)的時(shí)間為36h；和/或，第三培養(yǎng)的時(shí)間為48h。

7、如上所述的制備方法，其中，第二培養(yǎng)的時(shí)間為12-24h；和/或，第四培養(yǎng)的時(shí)間為120-168h。

8、如上所述的制備方法，其中，步驟3中，種子培養(yǎng)液和發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為(1-4)：50。

9、如上所述的制備方法，其中，菌種活化培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉2-4g/l、葡萄糖2-3g/l、蛋白胨0.5-1.5g/l、玉米漿干粉0.5-1.5g/l、瓊脂15-25g/l；和/或，菌種活化培養(yǎng)基的ph值為6.9-7.1。

10、如上所述的制備方法，其中，種子培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉4-6g/l、葡萄糖8-12g/l、黃豆餅粉4-6g/l、蛋白胨1.5-2.5g/l、玉米漿干粉0.5-1.5g/l、氯化鈉0.5-1.5g/l；和/或，種子培養(yǎng)基的ph值為6.9-7.1。

11、如上所述的制備方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉15-25g/l、糊精30-50g/l、葡萄糖8-12g/l、黃豆餅粉15-25g/l、玉米漿干粉4-6g/l、酵母粉4-6g/l、氯化鈉1.5-2.5g/l、碳酸鈣1.5-2.5g/l、硫酸銨0.8-1.2g/l、磷酸氫二鉀0.8-1.2g/l；和/或，發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為6.9-7.1。

12、如上所述的制備方法，其中，子囊霉素產(chǎn)生菌為吸水鏈霉菌atcc?14891。

13、如上所述的制備方法，其中，種子培養(yǎng)的條件包括：溫度為27-29℃，轉(zhuǎn)速為200-250r/min，時(shí)間為48-60小時(shí)。

14、如上所述的制備方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：溫度為27-29℃，轉(zhuǎn)速為200-250r/min，時(shí)間為168-216小時(shí)。

15、本發(fā)明提供一種子囊霉素的制備方法，通過菌種活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)步驟制備子囊霉素，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加適當(dāng)?shù)木鄱谆┍然@，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)子囊霉素產(chǎn)生菌的菌絲形態(tài)進(jìn)行調(diào)控，使其生長(zhǎng)為最有利于產(chǎn)生子囊霉素的形態(tài)并進(jìn)行最有利于產(chǎn)生子囊霉素的代謝途徑。本發(fā)明的制備方法制備得到的發(fā)酵產(chǎn)品無任何毒副作用，且制備方法工藝簡(jiǎn)單，不僅可以有效提高子囊霉素的產(chǎn)量，還能夠減少主要副產(chǎn)物fk523的比例，從而降低該結(jié)構(gòu)近似物雜質(zhì)對(duì)后續(xù)純化分離過程的影響，最終能夠降低生產(chǎn)成本并為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種子囊霉素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述第一培養(yǎng)的時(shí)間為36h；和/或，所述第三培養(yǎng)的時(shí)間為48h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述第二培養(yǎng)的時(shí)間為12-24h；和/或，所述第四培養(yǎng)的時(shí)間為120-168h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟3中，所述種子培養(yǎng)液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為(1-4)：50。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述菌種活化培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉2-4g/l、葡萄糖2-3g/l、蛋白胨0.5-1.5g/l、玉米漿干粉0.5-1.5g/l、瓊脂15-25g/l；和/或，所述菌種活化培養(yǎng)基的ph值為6.9-7.1。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉4-6g/l、葡萄糖8-12g/l、黃豆餅粉4-6g/l、蛋白胨1.5-2.5g/l、玉米漿干粉0.5-1.5g/l、氯化鈉0.5-1.5g/l；和/或，所述種子培養(yǎng)基的ph值為6.9-7.1。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉15-25g/l、糊精30-50g/l、葡萄糖8-12g/l、黃豆餅粉15-25g/l、玉米漿干粉4-6g/l、酵母粉4-6g/l、氯化鈉1.5-2.5g/l、碳酸鈣1.5-2.5g/l、硫酸銨0.8-1.2g/l、磷酸氫二鉀0.8-1.2g/l；和/或，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為6.9-7.1。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述子囊霉素產(chǎn)生菌為吸水鏈霉菌atcc?14891。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)的條件包括：溫度為27-29℃，轉(zhuǎn)速為200-250r/min，時(shí)間為48-60小時(shí)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：溫度為27-29℃，轉(zhuǎn)速為200-250r/min，時(shí)間為168-216小時(shí)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種子囊霉素的制備方法，通過菌種活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)步驟制備子囊霉素，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加適當(dāng)?shù)木鄱谆┍然@，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)子囊霉素產(chǎn)生菌的菌絲形態(tài)進(jìn)行調(diào)控，使其生長(zhǎng)為最有利于產(chǎn)生子囊霉素的形態(tài)并進(jìn)行最有利于產(chǎn)生子囊霉素的代謝途徑。本發(fā)明的制備方法制備得到的發(fā)酵產(chǎn)品無任何毒副作用，且制備方法工藝簡(jiǎn)單，不僅可以有效提高子囊霉素的產(chǎn)量，還能夠減少主要副產(chǎn)物去甲基子囊霉素的比例，從而降低該結(jié)構(gòu)近似物雜質(zhì)對(duì)后續(xù)純化分離過程的影響，最終能夠降低生產(chǎn)成本并為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：金明義,趙子剛,張葵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北大醫(yī)藥重慶大新藥業(yè)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/17