本發(fā)明涉及生物材料分離，特別涉及一種外周血單個核細胞及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、在現(xiàn)代醫(yī)學和生物學研究中，從人體外周血中提取單個核細胞是實驗室常規(guī)操作的一部分，尤其在免疫學研究、血液病診斷以及干細胞治療等領(lǐng)域扮演著關(guān)鍵角色。目前廣泛采用的一種技術(shù)是ficoll密度梯度離心法，該方法利用ficoll溶液形成的密度梯度來實現(xiàn)不同類型血細胞的分層和分離。

2、雖然這項技術(shù)已相對成熟，但現(xiàn)存的方法仍存在諸多限制，現(xiàn)有技術(shù)存在以下主要缺點：

3、1)操作繁瑣：鋪血技術(shù)較慢、較繁瑣，以及某些離心過程中需要精確控制溫度、轉(zhuǎn)速等多個參數(shù)，給操作帶來不便。

4、2)細胞損傷：過高的離心力可能對細胞膜造成物理性傷害，影響細胞活性及后續(xù)實驗結(jié)果的準確性。

5、3)效率低下：傳統(tǒng)的離心時間設(shè)置較長，這不僅增加了實驗的整體耗時，還消耗了更多的能源。

6、4)可重復性差：由于個體生物差異，固定的離心參數(shù)不能很好地適應所有樣本，導致結(jié)果的一致性較差。

7、5)成本問題：傳統(tǒng)方法可能需要昂貴的設(shè)備維護和高精度的控制，增加了經(jīng)濟負擔。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的是提出一種外周血單個核細胞及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的鋪血時間長、細胞損傷、低效率和可重復性差的問題。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種外周血單個核細胞的制備方法，包括以下步驟：

3、s10.獲取抗凝外周血和淋巴分離液，將淋巴細胞分離液置于離心管內(nèi)，用抗凝外周血潤濕所述離心管的內(nèi)側(cè)壁的至少一部分，沿著潤濕的離心管內(nèi)側(cè)壁向所述離心管內(nèi)添加抗凝外周血，得血漿樣品；

4、s20.將血漿樣品進行離心洗滌，取沉淀，得外周血單個核細胞。

5、在一實施例中，步驟s10包括以下步驟：

6、s11.將外周血與抗凝劑混合，得抗凝外周血；

7、s12.取ficoll密度梯度介質(zhì)作為淋巴分離液，將淋巴分離液置于離心管內(nèi)；

8、s13.用抗凝外周血潤濕所述離心管的內(nèi)側(cè)壁的至少一部分，沿著潤濕的離心管內(nèi)側(cè)壁向所述離心管內(nèi)添加抗凝外周血，得血漿樣品。

9、在一實施例中，步驟s13包括以下步驟：

10、s131.用移液管在分離液上方0.5?cm處，畫一條橫線，所述橫線的長度為離心管直徑的三分之一；

11、s132.以所述橫線的長度為一條邊，自下而上，至接近瓶口處，畫一個“長方形”；

12、s133.用移液管自上而下，從左往右平移，每次用少量的抗凝外周血，直到完全潤濕此“長方形”對應的離心管內(nèi)壁；

13、s134.潤濕所述離心管內(nèi)壁后，將移液管移至所述離心管內(nèi)壁最上方，從左往右進行鋪血，完成鋪血，得血漿樣品。

14、在一實施例中，步驟s10中，抗凝外周血和淋巴分離液的體積比為（1.8~2.2）：1。

15、在一實施例中，步驟s10中，所述離心管的容量為50?ml，抗凝外周血的體積為30ml，淋巴分離液的體積為15?ml。

16、在一實施例中，步驟s20中，離心步驟重復三次。

17、在一實施例中，步驟s20中，三次離心的離心力為300~1400?g；和/或，

18、第一次離心的時長為20~40?min；和/或，

19、第二次離心和第三次離心的時長相同，為8~12?min。

20、在一實施例中，步驟s20包括以下步驟：

21、s21.將血漿樣品進行離心后靜置分層，得分層細胞液；

22、s22.取分層細胞液中的中間層，與緩沖液混合，離心后棄去緩沖液，重復兩次，取沉淀，得外周血單個核細胞。

23、在一實施例中，所述緩沖液包括杜氏磷酸鹽緩沖液。

24、本發(fā)明還提出一種外周血單個核細胞，按如前述的外周血單個核細胞的制備方法制備得到。

25、本發(fā)明的技術(shù)方案通過將抗凝外周血鋪于淋巴分離液表面后離心處理，以減少抗凝外周血與淋巴分離液的混合，同時保持液面相接，以使得離心過程中，抗凝外周血能夠充分接觸淋巴分離液，避免因提前混合部分抗凝外周血被淋巴分離液包裹，導致內(nèi)部的抗凝外周血無法與淋巴分離液接觸而未分離出外周血單個核細胞，因此，按本方案的分離效率高。

技術(shù)特征：

1.一種外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，步驟s10包括以下步驟：

3.如權(quán)利要求2所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，步驟s13包括以下步驟：

4.如權(quán)利要求1所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，步驟s10中，抗凝外周血和淋巴分離液的體積比為（1.8~2.2）：1。

5.如權(quán)利要求4所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，步驟s10中，所述離心管的容量為50?ml，抗凝外周血的體積為30?ml，淋巴分離液的體積為15?ml。

6.如權(quán)利要求1所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，步驟s20中，離心步驟重復三次。

7.如權(quán)利要求6所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，步驟s20中，三次離心的離心力為300~1400?g；和/或，

8.如權(quán)利要求6所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，步驟s20包括以下步驟：

9.如權(quán)利要求8所述的外周血單個核細胞的制備方法，其特征在于，所述緩沖液包括杜氏磷酸鹽緩沖液。

10.一種外周血單個核細胞，其特征在于，按如權(quán)利要求1至9任一項所述的外周血單個核細胞的制備方法制備得到。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提出一種外周血單個核細胞及其制備方法，涉及生物材料分離技術(shù)領(lǐng)域，其中，外周血單個核細胞的制備方法包括以下步驟：S10.獲取抗凝外周血和淋巴分離液，將淋巴分離液置于離心管內(nèi)，再將抗凝外周血鋪于淋巴分離液表面，得血漿樣品；S20.將血漿樣品進行離心洗滌，取沉淀，得外周血單個核細胞。本發(fā)明的技術(shù)方案通過將抗凝外周血鋪于淋巴分離液表面后離心處理，以減少抗凝外周血與淋巴分離液的混合，同時保持液面相接，以使得離心過程中，抗凝外周血能夠充分接觸淋巴分離液，避免因提前混合部分抗凝外周血被淋巴分離液包裹，導致內(nèi)部的抗凝外周血無法與淋巴分離液接觸而未分離出外周血單個核細胞，因此，按本方案的分離效率高。

技術(shù)研發(fā)人員：智曉瑩,姚夢薇,崔奎琰,王麗,范波鱗,馮晨晨,尹立東,劉瑩
受保護的技術(shù)使用者：深圳市邁科龍生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10