本發(fā)明涉及疾病診斷器材，尤其是一種掛鎖探針擴(kuò)增的短片段和其制備方法及其在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(isothermalamplification?technology)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物來達(dá)到快速擴(kuò)增核酸的目的。目前已有多種等溫?cái)U(kuò)增的方法(lamp、rpa、hda)，傳統(tǒng)的方法需要一小時(shí)左右的擴(kuò)增.

2、目前使用試紙條對呼吸道病毒進(jìn)行檢測主要包括兩類:1、膠體金試紙條利用膠體金納米顆粒作為標(biāo)記物，通過特異性抗體與目標(biāo)抗原的結(jié)合來檢測樣本中的特定物質(zhì)。2、熒光試紙條中的抗體或抗原被熒光染料標(biāo)記。當(dāng)熒光標(biāo)記的探針與樣本中的特定目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生熒光信號。傳統(tǒng)方法都是對抗原進(jìn)行檢測。

3、lamp、rpa、hda擴(kuò)增時(shí)間長，對引物要求高，需要多種酶，使得反應(yīng)體系復(fù)雜且不穩(wěn)定，設(shè)計(jì)困難.使用膠體金試紙條進(jìn)行抗原抗體檢測相對于核酸檢測體系，準(zhǔn)確性較差，易受到其他物質(zhì)、藥物以及樣品處理等因素的影響.熒光試紙條檢測抗原抗體，檢測操作復(fù)雜，檢測需專業(yè)設(shè)備同時(shí)設(shè)備成本高，檢測的結(jié)果可能會(huì)受到樣品質(zhì)量和操作技巧的影響。

4、因此，需要設(shè)計(jì)一種掛鎖探針擴(kuò)增的短片段和其制備方法及其在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種掛鎖探針擴(kuò)增的短片段和其制備方法及其在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明通過下述方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種掛鎖探針擴(kuò)增的短片段，包括單鏈短片段，所述單鏈短片段與檢測探針對應(yīng)結(jié)合，在所述檢測探針上對應(yīng)修飾有生物素；

4、所述檢測探針上修飾的生物素可與修飾有鏈霉親核酸的金球?qū)?yīng)結(jié)合，所述單鏈短片段可與對應(yīng)的捕獲探針結(jié)合；

5、所述單鏈短片段為目標(biāo)核酸序列與其互補(bǔ)配對的特異性掛鎖探針進(jìn)行擴(kuò)增后切割得到的產(chǎn)物。

6、所述單鏈短片段包括不同的目標(biāo)核酸序列與其對應(yīng)的互補(bǔ)配對的特異性掛鎖探針進(jìn)行擴(kuò)增后切割得到的混合產(chǎn)物。

7、所述混合產(chǎn)物可與不同的捕獲探針分別對應(yīng)結(jié)合。

8、所述捕獲探針分別固定在不同區(qū)域。

9、掛鎖探針擴(kuò)增的短片段的制備方法，該方法包括以下步驟：

10、將目標(biāo)核酸序列與設(shè)計(jì)好的掛鎖探針進(jìn)行互補(bǔ)配對，在連接酶的作用下形成環(huán)狀dna，再進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出來的產(chǎn)物是長單鏈，引入內(nèi)切酶將長單鏈切割，即得掛鎖探針擴(kuò)增的短片段。

11、所述連接酶為t4連接酶。

12、加入phi29和引物進(jìn)行擴(kuò)增。

13、掛鎖探針擴(kuò)增的短片段在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用，將所述掛鎖探針擴(kuò)增的短片段與修飾有生物素的檢測探針在37℃共孵育，然后滴加在多重疾病診斷試紙條上，通過層析作用，修飾了生物素的檢測探針先與修飾鏈霉親核酸的金球結(jié)合，形成掛鎖探針擴(kuò)增的短片段、修飾有生物素的檢測探針、修飾鏈霉親核酸的金球依次結(jié)合的鏈狀結(jié)構(gòu)，在流經(jīng)不同的捕獲探針區(qū)域時(shí)，單鏈短片段將與不同的捕獲探針內(nèi)的捕獲探針相連，造成鏈狀結(jié)構(gòu)與捕獲探針相結(jié)合，鏈狀結(jié)構(gòu)的金球此時(shí)就會(huì)富集于含有該捕獲探針的捕獲探針區(qū)域處，從而進(jìn)行顯色。

14、在所述多重疾病診斷試紙條上設(shè)置有不同的捕獲探針區(qū)域，不同的捕獲探針區(qū)域內(nèi)分別設(shè)有不同的捕獲探針，不同的捕獲探針分別與不同的單鏈短片段對應(yīng)集合。

15、所述多重疾病診斷試紙條包括設(shè)置的修飾鏈霉親核酸的金球，在所述多重疾病診斷試紙條上還對應(yīng)設(shè)有捕獲探針區(qū)域，在所述捕獲探針區(qū)域內(nèi)對應(yīng)設(shè)有捕獲探針，所述捕獲探針可與掛鎖探針擴(kuò)增的短片段的單鏈短片段對應(yīng)結(jié)合；

16、所述掛鎖探針擴(kuò)增的短片段包括單鏈短片段，所述單鏈短片段與檢測探針對應(yīng)結(jié)合，在所述檢測探針上對應(yīng)修飾有生物素。

17、本發(fā)明的有益效果為：

18、1.本發(fā)明通過技術(shù)特征是針對不同的靶標(biāo)設(shè)計(jì)特異性掛鎖，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增完的產(chǎn)物用酶切割成片段化的單鏈。在單個(gè)試紙條的不同區(qū)域固定不同的捕獲探針，同時(shí)在金球上固定鏈霉親核素，當(dāng)目標(biāo)靶標(biāo)存在的情況下，先與檢測探針互補(bǔ)配對，通過層析作用再與金球結(jié)合，到達(dá)捕獲探針位置被特異的捕獲，可以多靶標(biāo)同時(shí)檢測，可以一次性檢測多個(gè)靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)包括多重呼吸道疾病在內(nèi)的疾病的同時(shí)檢測。

19、2.本發(fā)明檢測精度高，通過對目標(biāo)靶標(biāo)的擴(kuò)增，在試紙條上可以檢測到am級別的靶標(biāo)。

20、3.本發(fā)明操作簡便，滾環(huán)擴(kuò)增設(shè)計(jì)簡單，使用膠體金試紙條進(jìn)行檢測可肉眼直接觀察。

技術(shù)特征：

1.一種掛鎖探針擴(kuò)增的短片段，包括單鏈短片段，其特征在于：所述單鏈短片段與檢測探針對應(yīng)結(jié)合，在所述檢測探針上對應(yīng)修飾有生物素；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種激活型熒光探針，其特征在于：所述單鏈短片段包括不同的目標(biāo)核酸序列與其對應(yīng)的互補(bǔ)配對的特異性掛鎖探針進(jìn)行擴(kuò)增后切割得到的混合產(chǎn)物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種激活型熒光探針，其特征在于：所述混合產(chǎn)物可與不同的捕獲探針分別對應(yīng)結(jié)合。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種激活型熒光探針，其特征在于：所述捕獲探針分別固定在不同區(qū)域。

5.一種制備如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)權(quán)利要求的掛鎖探針擴(kuò)增的短片段的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的掛鎖探針擴(kuò)增的短片段的制備方法，其特征在于：所述連接酶為t4連接酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的掛鎖探針擴(kuò)增的短片段的制備方法，其特征在于：加入phi29和引物進(jìn)行擴(kuò)增。

8.一種如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)權(quán)利要求的掛鎖探針擴(kuò)增的短片段在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用，其特征在于：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的掛鎖探針擴(kuò)增的短片段在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用，其特征在于：在所述多重疾病診斷試紙條上設(shè)置有不同的捕獲探針區(qū)域，不同的捕獲探針區(qū)域內(nèi)分別設(shè)有不同的捕獲探針，不同的捕獲探針分別與不同的單鏈短片段對應(yīng)集合。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的掛鎖探針擴(kuò)增的短片段在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用，其特征在于：所述多重疾病診斷試紙條包括設(shè)置的修飾鏈霉親核酸的金球，在所述多重疾病診斷試紙條上還對應(yīng)設(shè)有捕獲探針區(qū)域，在所述捕獲探針區(qū)域內(nèi)對應(yīng)設(shè)有捕獲探針，所述捕獲探針可與掛鎖探針擴(kuò)增的短片段的單鏈短片段對應(yīng)結(jié)合；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種掛鎖探針擴(kuò)增的短片段，包括單鏈短片段，所述單鏈短片段與檢測探針對應(yīng)結(jié)合，在所述檢測探針上對應(yīng)修飾有生物素；所述檢測探針上修飾的生物素可與修飾有鏈霉親核酸的金球?qū)?yīng)結(jié)合，所述單鏈短片段可與對應(yīng)的捕獲探針結(jié)合；所述單鏈短片段為目標(biāo)核酸序列與其互補(bǔ)配對的特異性掛鎖探針進(jìn)行擴(kuò)增后切割得到的產(chǎn)物。還公開了掛鎖探針擴(kuò)增的短片段的制備方法及掛鎖探針擴(kuò)增的短片段在制備多重疾病診斷試紙條中的應(yīng)用。本發(fā)明可以多靶標(biāo)同時(shí)檢測，可以一次性檢測多個(gè)靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)包括多重呼吸道疾病在內(nèi)的疾病的同時(shí)檢測，在試紙條上可以檢測到aM級別的靶標(biāo)，操作簡便，滾環(huán)擴(kuò)增設(shè)計(jì)簡單，使用膠體金試紙條進(jìn)行檢測可肉眼直接觀察。

技術(shù)研發(fā)人員：王鵬飛,徐志豪,楊棟磊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/14