本發(fā)明屬于植物基因工程，更具體地說，涉及盾片特異表達(dá)基因osmyb80在抑制水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻是我國的主要糧食作物，對保障國家糧食安全發(fā)揮著決定性的作用。水稻種子的休眠期對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種子保存具有重要的意義。對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說，掌握好種子的休眠規(guī)律可以使種子在最適宜的時間內(nèi)發(fā)芽生長，提高收成；對于種子保存來說，了解種子的休眠規(guī)律可以幫助選取最佳的保存溫度、濕度等因素，延長種子的保存期限。

2、在水稻種子萌發(fā)時，胚中g(shù)a調(diào)控盾片上皮細(xì)胞或胚乳糊粉層產(chǎn)生淀粉酶，將胚乳中的貯藏淀粉分解成葡萄糖，運(yùn)往胚細(xì)胞，經(jīng)呼吸作用產(chǎn)生atp，為萌發(fā)提供能量，因此盾片成為了調(diào)控種子萌發(fā)的開關(guān)。

3、種子休眠是指種子在適合它生長的條件下仍不能發(fā)芽的現(xiàn)象。然而，作物馴化過程中，由于更多考慮高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲等性狀，常常忽視了對種子適度休眠性狀的保留，從而導(dǎo)致很多作物如水稻、小麥會發(fā)生穗發(fā)芽現(xiàn)象。穗發(fā)芽，也稱為收獲前發(fā)芽(preharvestsprouting，phs)，是指在收獲前麥粒在麥穗上發(fā)芽的現(xiàn)象。這是一種不正常的現(xiàn)象，通常是由于成熟到收割這段時間陰雨連綿、環(huán)境潮濕所導(dǎo)致的。不僅影響籽粒品質(zhì)，同時影響小麥貯存及下季或翌年播種質(zhì)量，對小麥生產(chǎn)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。水稻休眠不足導(dǎo)致穗發(fā)芽(收獲前發(fā)芽)，嚴(yán)重影響我國乃至世界范圍內(nèi)的糧食產(chǎn)量和質(zhì)量，進(jìn)而影響生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益，特別是我國長江流域的高溫高濕環(huán)境，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大的損失。水稻種子休眠是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，目前從分子水平鑒定的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常有限，阻礙了種子休眠品種的選育。因此，開展水稻休眠調(diào)控相關(guān)基因的研究與鑒定具有重要的應(yīng)用價值，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段改造和調(diào)節(jié)水稻休眠性，創(chuàng)制休眠強(qiáng)度不同的水稻種質(zhì)資源，對指導(dǎo)適應(yīng)特定區(qū)域的水稻品種選育，提高水稻的適應(yīng)性和產(chǎn)量，具有重要的理論和實踐意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供盾片特異表達(dá)基因osmyb80在抑制水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用，用于抑制水稻穗發(fā)芽(收獲前發(fā)芽)。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、盾片特異表達(dá)基因osmyb80在調(diào)控水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用，所述osmyb80基因的cds核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4、所述的應(yīng)用為通過抑制osmyb80基因表達(dá)來減少水稻穗發(fā)芽。

5、所述的應(yīng)用，步驟如下：

6、1)構(gòu)建水稻osmyb80基因的敲除載體；

7、2)將構(gòu)建的水稻osmyb80基因的敲除載體轉(zhuǎn)化到水稻中；

8、3)培育篩選并獲得穗發(fā)芽率顯著降低的轉(zhuǎn)基因水稻植株。

9、所述的應(yīng)用，所述敲除載體為植物表達(dá)載體。

10、所述的應(yīng)用，所述水稻osmyb80基因敲除載體的構(gòu)建方法為：根據(jù)抑制osmyb80基因表達(dá)的grna靶序列設(shè)計oligo引物，配置反應(yīng)體系合成oligo二聚體；將oligo二聚體構(gòu)建至crispr/cas載體中，即得到水稻osmyb80基因敲除載體。

11、所述的應(yīng)用，所述抑制osmyb80基因表達(dá)的grna靶序列為：

12、①crispr-osmyb80：5'-gcaagctctagccatggcaccgg-3'；

13、或②crispr-osmyb80：5'-caccatggcagtcccggacatgg-3'。

14、所述oligo引物序列如下所示：

15、①oligo-f：5’-tgtgtggcaagctctagccatggcaccgg-3’；

16、oligo-r：5’-aaacccggtgccatggctagagcttgcca-3’。

17、②oligo-f：5’-tgtgtgcaccatggcagtcccggacatgg-3’；

18、oligo-r：5’-aaacccatgtccgggactgccatggtgca-3’。

19、所述的水稻osmyb80基因的敲除載體在抑制水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用。

20、盾片特異表達(dá)基因osmyb80的突變體在調(diào)控水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用，所述osmyb80基因的cds核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述的突變體為在seq?id?no.2所示的序列上的任一位置進(jìn)行突變，且該突變能引起osmyb80基因的蛋白表達(dá)終止。

21、所述的突變包括點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變。

22、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

23、1)本發(fā)明公開的水稻osmyb80基因，其cds核苷酸序列如seq?id?no.2所示，其表達(dá)蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。本發(fā)明構(gòu)建水稻osmyb80基因的敲除載體；將構(gòu)建的敲除載體轉(zhuǎn)化到水稻中；培育篩選并獲得穗發(fā)芽率顯著降低的轉(zhuǎn)基因水稻植株。結(jié)果表明，敲除osmyb80基因后顯著降低了轉(zhuǎn)基因水稻的穗發(fā)芽率。

24、2)本發(fā)明最終獲得水稻osmyb80基因靶位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)基因純合體植株myb80-11和myb80-176。myb80-11純合突變體表現(xiàn)為在靶點(diǎn)①插入一個堿基，導(dǎo)致蛋白編碼移碼；myb80-176純合突變體表現(xiàn)為在靶點(diǎn)②缺失八個堿基，導(dǎo)致蛋白編碼移碼。兩種純合突變形式都造成蛋白編碼移碼，造成蛋白功能缺失。

25、3)與對照組相比，myb80-11和myb80-176純合突變體株系的穗發(fā)芽率明顯降低，幾乎不存在穗發(fā)芽現(xiàn)象。

技術(shù)特征：

1.盾片特異表達(dá)基因osmyb80在調(diào)控水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用，所述osmyb80基因的cds核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為通過抑制osmyb80基因表達(dá)來減少水稻穗發(fā)芽。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述敲除載體為植物表達(dá)載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻osmyb80基因敲除載體的構(gòu)建方法為：根據(jù)抑制osmyb80基因表達(dá)的grna靶序列設(shè)計oligo引物，配置反應(yīng)體系合成oligo二聚體；將oligo二聚體構(gòu)建至crispr/cas載體中，即得到水稻osmyb80基因敲除載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制osmyb80基因表達(dá)的grna靶序列為：

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述oligo引物序列如下所示：

8.權(quán)利要求5所述的水稻osmyb80基因的敲除載體在抑制水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用。

9.盾片特異表達(dá)基因osmyb80的突變體在調(diào)控水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用，所述osmyb80基因的cds核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述的突變體為在seq?id?no.2所示的序列上的任一位置進(jìn)行突變，且該突變能引起osmyb80基因的蛋白表達(dá)終止。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的突變包括點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了盾片特異表達(dá)基因OsMYB80在抑制水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用，涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的盾片特異表達(dá)基因OsMYB80在調(diào)控水稻穗發(fā)芽中的應(yīng)用，通過調(diào)控OsMYB80基因表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控水稻穗發(fā)芽的目的；所述OsMYB80基因的CDS核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，其表達(dá)蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。本發(fā)明構(gòu)建水稻OsMYB80基因的敲除載體；將構(gòu)建的敲除載體轉(zhuǎn)化到水稻中；培育篩選并獲得穗發(fā)芽率顯著降低的轉(zhuǎn)基因水稻植株。結(jié)果表明，敲除OsMYB80基因后顯著降低了轉(zhuǎn)基因水稻的穗發(fā)芽率。

技術(shù)研發(fā)人員：劉磊,趙祥祥,曾紫陽,吳德鵬,劉福霞,裔新,于文庚,楊恒軒,古炫炫,白姝雯
受保護(hù)的技術(shù)使用者：淮陰師范學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10