本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)l-纈氨酸的谷氨酸棒桿菌重組菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程。

背景技術(shù)：

1、l-纈氨酸(l-valine)，與異亮氨酸和亮氨酸合稱分支鏈氨基酸(branched?chainamino?acids,bcaa)，分子式為c5h11no2，密度1.316g/cm3，相對分子量為117.46，白色結(jié)晶或粉末，溶于水，25℃時水中溶解度為88.5g/l，且纈氨酸分子是手性分子，根據(jù)偏振光的旋轉(zhuǎn)方向分為d型和l型，天然的纈氨酸都為l-纈氨酸。

2、l-纈氨酸是人體中的八大必需氨基酸之一，不能通過自身合成，必須依賴外源供給，l-纈氨酸廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域。目前，l-纈氨酸主要通過直接提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法進行工業(yè)生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法有產(chǎn)量穩(wěn)定、反應條件溫和、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點，是目前世界上l-纈氨酸生產(chǎn)的主要方法。谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)作為作為食品安全級的微生物，目前常用于l-纈氨酸等多種氨基酸生產(chǎn)的菌株，有易培養(yǎng)、不產(chǎn)孢子等諸多優(yōu)點，是一類重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株。

3、目前，谷氨酸棒狀桿菌中l(wèi)-纈氨酸的生物合成路徑已經(jīng)明確。葡萄糖經(jīng)過emp途徑生成的丙酮酸，丙酮酸再通過4步反應合成l-纈氨酸。丙酮酸作為l-纈氨酸的前體，富集丙酮酸池對提高l-纈氨酸生產(chǎn)有著重要意義。隨著l-纈氨酸市場需求的不斷增加，借助單一代謝工程策略改造獲得的工程菌株，仍然面臨著產(chǎn)酸效率低，糖酸轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)強度低等問題，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。另一方面，現(xiàn)有技術(shù)中的谷氨酸棒桿菌(例如公開號為cn116333956a的菌株)雖然能夠獲得較高的產(chǎn)量，但隨著發(fā)酵周期的延長，菌體會伴隨高濃度l-纈氨酸的析出，進而l-纈氨酸的合成能力受到限制無法進一步提高。因此，進一步提高l-纈氨酸的生產(chǎn)強度是l-纈氨酸發(fā)酵工業(yè)技術(shù)開發(fā)和發(fā)酵工程化研究的熱點，對于促進l-纈氨酸的工業(yè)生產(chǎn)進程具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供提高l-纈氨酸生產(chǎn)強度的重組谷氨酸棒桿菌，使菌株能夠在較短的發(fā)酵時間內(nèi)獲得較高的l-纈氨酸產(chǎn)量。

2、本發(fā)明提供了一種l-纈氨酸生產(chǎn)效率提高的谷氨酸棒桿菌，以谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)k007或k020為出發(fā)菌株，具有如下改進：

3、采用啟動子pgapa串聯(lián)表達乙酰羥酸合酶的編碼基因ilvbnm與乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的編碼基因ilvcsm，過表達了谷氨酸棒桿菌本源的轉(zhuǎn)酮酶(tkt)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)，并弱化了丙酮酸脫氫酶(acee)的表達。

4、在一種實施方式中，所述弱化了丙酮酸脫氫酶(acee)的表達是將丙酮酸脫氫酶(acee)的編碼基因的第一位核苷酸由a突變?yōu)間，獲得seq?id?no.8所示的核苷酸序列。

5、在一種實施方式中，所述谷氨酸棒桿菌k007是在谷氨酸棒桿菌fmme-446的基礎(chǔ)上，ptac啟動子替換了pfka和pyk基因原啟動子，敲除了ldh、pta、alat和ppc基因；所述谷氨酸棒桿菌fmme-446的保藏編號為cctcc?no:m?2023147，已公開于公開號為cn116333956a的專利申請文件中。

6、在一種實施方式中，所述谷氨酸棒桿菌k020是在所述谷氨酸棒狀桿菌fmme-446中，過表達了6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，將6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的啟動子替換為ptac啟動子，并敲除了乳酸脫氫酶、磷酸轉(zhuǎn)乙?；?、丙氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，并采用啟動子pgapa串聯(lián)表達乙酰羥酸合酶的編碼基因ilvbnm與乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的編碼基因ilvcsm，并將nadh依賴型亮氨酸脫氫酶插入ilve位點；所述谷氨酸棒桿菌k020公開于公開號為cn116333956a的專利申請文件中。

7、在一種實施方式中，所述轉(zhuǎn)酮酶的編碼基因整合在alat位點(gene?id:2830649)。

8、在一種實施方式中，所述谷氨酸棒桿菌本源的轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述丙酮酸脫氫酶的acee基因的核苷酸序列如seq?id?no.2或seq?idno.8所示，所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因的核苷酸序列如seq?id?no.3。

9、在一種實施方式中，所述啟動子pgapa的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述乙酰羥酸合酶的編碼基因ilvbnm的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的編碼基因ilvcsm的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

10、本發(fā)明還提供一種提高谷氨酸棒桿菌l-纈氨酸生產(chǎn)強度的方法，是對谷氨酸棒桿菌進行如下改進：采用啟動子pgapa串聯(lián)表達乙酰羥酸合酶的編碼基因ilvbnm與乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的編碼基因ilvcsm，過表達谷氨酸棒桿菌本源的轉(zhuǎn)酮酶(tkt)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)，并弱化丙酮酸脫氫酶(acee)的表達。

11、在一種實施方式中，所述弱化了丙酮酸脫氫酶(acee)的表達是將丙酮酸脫氫酶(acee)的編碼基因的第一位核苷酸由a突變?yōu)間。

12、本發(fā)明還提供應用所述重組谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)l-纈氨酸的方法。

13、在一種實施方式中，所述方法是將所述谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30℃發(fā)酵至少24h。

14、在一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源包括但不限于葡萄糖。

15、在一種實施方式中，發(fā)酵時間為24～48h。

16、在一種實施方式中，發(fā)酵過程中還補料葡萄糖，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度在50-100g/l,ph值控制在6.0-8.0，36h后停止補加葡萄糖至發(fā)酵結(jié)束。

17、在一種實施方式中，使用濃度為30％的氨水調(diào)控ph。

18、在一種實施方式中，發(fā)酵過程先控制轉(zhuǎn)速為300-500rpm，并通入0.1-1vvm的空氣，發(fā)酵至9h時改為微溶氧發(fā)酵，轉(zhuǎn)速降低到100～200r/min。

19、本發(fā)明還提供了所述重組谷氨酸棒桿菌或所述方法在生產(chǎn)l-纈氨酸或含l-纈氨酸的產(chǎn)品中的應用。

20、有益效果：

21、本發(fā)明構(gòu)建的重組谷氨酸棒桿菌能夠以葡萄糖為底物，在短時間內(nèi)獲得較高的l-纈氨酸。該菌株發(fā)酵過程操作便捷，l-纈氨酸產(chǎn)量更高。在5l發(fā)酵罐中，發(fā)酵44h的產(chǎn)量可達100.8g/l，生產(chǎn)強度為2.29g/l/h。

技術(shù)特征：

1.一種l-纈氨酸生產(chǎn)強度提高的重組谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)，其特征在于，在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上具有如下改進：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述轉(zhuǎn)酮酶的編碼基因tkt整合在alat位點。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述丙酮酸脫氫酶的編碼基因的第一位核苷酸由a突變?yōu)間。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述谷氨酸棒桿菌本源的轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述丙酮酸脫氫酶的acee基因的核苷酸序列如seq?id?no.2或seq?id?no.8所示，所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因的核苷酸序列如seq?id?no.3；所述啟動子pgapa的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述乙酰羥酸合酶的編碼基因ilvbnm的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的編碼基因ilvcsm的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

5.一種提高谷氨酸棒桿菌l-纈氨酸生產(chǎn)強度的方法，其特征在于，對谷氨酸棒桿菌進行如下改進：采用啟動子pgapa串聯(lián)表達乙酰羥酸合酶的編碼基因ilvbnm與乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的編碼基因ilvcsm，過表達谷氨酸棒桿菌本源的轉(zhuǎn)酮酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，并弱化丙酮酸脫氫酶的表達。

6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述弱化了丙酮酸脫氫酶的表達是將丙酮酸脫氫酶的編碼基因acee的第一位核苷酸由a突變?yōu)間。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒桿菌是谷氨酸棒桿菌k007或谷氨酸棒桿菌k020。

8.一種發(fā)酵生產(chǎn)l-纈氨酸的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～4任一所述的重組谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30～37℃發(fā)酵至少24h；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源包括但不限于葡萄糖。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，發(fā)酵過程中還補料葡萄糖，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度在50-100g/l。

10.權(quán)利要求1～4任一所述的重組谷氨酸棒桿菌，或權(quán)利要求5～9任一所述的方法在生產(chǎn)l-纈氨酸或含l-纈氨酸的產(chǎn)品中的應用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)L?纈氨酸的谷氨酸棒桿菌重組菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在谷氨酸棒桿菌中過表達了谷氨酸棒桿菌本源的轉(zhuǎn)酮酶(tkt)，對丙酮酸脫氫酶(aceE)第一位核苷酸進行了由A突變?yōu)镚的替換，并過表達了谷氨酸棒桿菌本源磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)，富集了丙酮酸池，增強了L?纈氨酸生產(chǎn)的碳流，構(gòu)建了高效的L?纈氨酸生產(chǎn)菌株。本發(fā)明構(gòu)建的重組菌VL?7在5L發(fā)酵罐發(fā)酵44h的L?纈氨酸積累量達100.8g?L<supgt;?1</supgt;，轉(zhuǎn)化率為46.1％，生產(chǎn)強度為2.29g/L/h。

技術(shù)研發(fā)人員：劉立明,于海浪,柳亞迪,劉佳,高聰,胡貴鵬,盛琦
受保護的技術(shù)使用者：江南大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10