本發(fā)明涉及病毒檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法。

背景技術(shù)：

1、小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(goose?parvovirus，gpv)引起雛鵝的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病，該病毒能通過種蛋、精液等將病毒傳播給下一代，生產(chǎn)中常發(fā)生野毒株隱性帶毒。為預(yù)防小鵝瘟病毒感染，最有效的方式是注射高免卵黃抗體或疫苗免疫，目前市面的小鵝瘟疫苗獲得了10個(gè)批文，均為減毒活疫苗，毒株分別為syg26-35、syg41-50和gd株。其中兩個(gè)批文疫苗使用syg26-35、syg41-50株，其余8個(gè)批文疫苗均使用gd株。雖減毒活疫苗毒力減弱，但仍具有復(fù)制能力，也存在排毒和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，常規(guī)的血清學(xué)、pcr法或熒光pcr法無法區(qū)分野毒隱性感染和疫苗株病毒復(fù)制，因此生產(chǎn)中急需一種靈敏高效的檢測手段，區(qū)分活疫苗復(fù)制還是野毒隱性感染，用于種鵝場gpv檢測、凈化，活疫苗散毒風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等，保障群體健康。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法。本方法的特異性強(qiáng)、適用性廣、靈敏度高，能區(qū)分市面上僅有的3株活疫苗株syg26-35、syg41-50、gd株和絕大多數(shù)gpv野毒株，包括經(jīng)典gpv、番鴨細(xì)小病毒和新型小鵝瘟病毒毒株。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法根據(jù)gpv疫苗株相較于與野毒株，包括如下：根據(jù)gpv疫苗株相較于與野毒株，在rep基因上發(fā)生了特異的單堿基突變t<c，形成了一個(gè)回文序列acatgt，包含一個(gè)pcii酶切位點(diǎn)，針對該區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性pcr擴(kuò)增引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)pcii限制性內(nèi)切酶切后，疫苗株擴(kuò)增片段被切割成兩條帶，而野毒株不被切割，形成單一條帶。

3、優(yōu)選地，該gpv疫苗株為syg26-35、syg41-50、gd株。

4、優(yōu)選地，gpv疫苗株相較于與野毒株序列，位于非結(jié)構(gòu)蛋白rep基因上存在一個(gè)c/t的多態(tài)性，該位點(diǎn)在所有的疫苗株上為c，在野毒株上為t。

5、優(yōu)選地，所述特異性pcr擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)要求：引物結(jié)合部位的序列保守性較高，即使在不同疫苗株和野毒株間存在個(gè)別堿基突變，但不能為引物結(jié)合位置的3’端，保證能同時(shí)擴(kuò)增不同的gpv疫苗株和野毒株，并要求引物的上下游與突變位點(diǎn)的距離存在差異，保證經(jīng)酶切后能通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分大小。

6、優(yōu)選地，所述特異性pcr擴(kuò)增引物為：

7、gpv-rep-f3：ctgtgcggctgggtgaag；

8、gpv-rep-r3：cgttcgggttctctgtctgg，

9、最適退火溫度為55℃，pcr擴(kuò)增后形成大小為1088bp單一條帶。

10、優(yōu)選地，擴(kuò)增片段只有1個(gè)pcii限制性酶切位點(diǎn)。

11、優(yōu)選地，所述疫苗株擴(kuò)增片段被pcii限制性酶切割，瓊脂糖凝膠電泳后檢測到大小為324bp和764bp的兩條片段，野毒株pcr片段不被切割，瓊脂糖凝膠電泳后檢測到大小為1088bp的一條片段。

12、優(yōu)選地，pcii限制性酶切pcr片段的最優(yōu)酶用量為1iu，切割100ng，最適酶切溫度為37℃，最適反應(yīng)時(shí)間為1h，切割100ngpcr產(chǎn)物，最適酶切溫度為37℃，最適反應(yīng)時(shí)間為1h。。

13、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

14、本方法合成一對特異性的引物，擴(kuò)增gpv的rep基因的一個(gè)片段，該片段上存在一個(gè)gpv疫苗株和野毒株特異性的單堿基多態(tài)性，該位點(diǎn)在疫苗株上形成了一個(gè)回文序列acatgt，產(chǎn)生了pcii的酶切位點(diǎn)，使用pcii限制酶酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，疫苗株能被切割成兩個(gè)片段，而野毒株不被切割，形成單一條帶，該方法為gpv病原鑒定、種鵝場gpv凈化、疫苗株散毒風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、小鵝瘟無疫區(qū)建設(shè)提供可靠的工具。本方法的特異性強(qiáng)、適用性廣、靈敏度高，能區(qū)分市面上僅有的3株活疫苗株syg26-35、syg41-50、gd株和絕大多數(shù)gpv野毒株，包括經(jīng)典gpv、番鴨細(xì)小病毒和新型小鵝瘟病毒。

技術(shù)特征：

1.一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于，包括如下：根據(jù)gpv疫苗株相較于與野毒株，在rep基因上發(fā)生了特異的單堿基突變t<c，形成了一個(gè)回文序列acatgt，包含一個(gè)pcii酶切位點(diǎn)，針對該區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)pcii限制性內(nèi)切酶切割后，疫苗株擴(kuò)增片段被切割成兩條帶，而野毒株不被切割，形成單一條帶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：擴(kuò)增片段只有1個(gè)pcii限制性酶切位點(diǎn)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：所述疫苗株擴(kuò)增片段被pcii限制性酶切割，瓊脂糖凝膠電泳后檢測到大小為324bp和764bp的兩條片段，野毒株pcr片段不被切割，瓊脂糖凝膠電泳后檢測到大小為1088bp的一條片段。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的pcr-rflp法，其特征在于：pcii限制性酶切pcr片段的最優(yōu)酶用量為1iu，切割100ng，最適酶切溫度為37℃，最適反應(yīng)時(shí)間為1h，切割100ngpcr產(chǎn)物，最適酶切溫度為37℃，最適反應(yīng)時(shí)間為1h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種鑒別小鵝瘟病毒減毒活疫苗株與野毒株的PCR?RFLP法，涉及病毒檢測領(lǐng)域，本發(fā)明的技術(shù)方案比較GPV疫苗株和野毒株病毒基因組，疫苗株在Rep基因上發(fā)生了一個(gè)特異性的T<C堿基突變，產(chǎn)生了一個(gè)PciI酶切位點(diǎn)，針對該位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)PciI限制性內(nèi)切酶切割，疫苗株擴(kuò)增片段被切割成兩條帶，而野毒株不被切割，形成單一條帶。本方法能區(qū)分市面上僅有的3株活疫苗株SYG26?35、SYG41?50、GD株和絕大多數(shù)GPV野毒株，特異性強(qiáng)、適用性廣、靈敏度高，為GPV病原學(xué)研究、疫病凈化、活疫苗散毒風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和無疫標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖場建設(shè)等提供可靠的檢測工具。

技術(shù)研發(fā)人員：張克山,高廣亮,王雪玫,王啟貴,陳主平,鐘航,王珍,李來旭,何信群
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶市畜牧科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10