本發(fā)明涉及一種凝血酶檢測技術(shù)，特別涉及一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應，用于凝血酶的靈敏特異檢測。

背景技術(shù)：

1、dna已經(jīng)成為多個領(lǐng)域的核心材料，包括診斷、治療、分子計算和納米設(shè)備。dna在納米技術(shù)中的應用主要歸功于其可預測的沃森-克里克堿基配對以及我們對其雜交熱力學和動力學的全面理解。toehold介導的鏈置換(tmsd)和toehold交換是入侵鏈通過形成堿基對競爭性置換dna雙鏈中一條鏈的過程，這促進了動態(tài)dna系統(tǒng)的開發(fā)。盡管連續(xù)操作的動態(tài)系統(tǒng)，包括反應網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和合成分子機器，已經(jīng)被開發(fā)出來，但最先進的技術(shù)仍未達到與天然對應物的功能性和靈活性相匹配的水平。

2、催化反應在化學和生物系統(tǒng)中起著重要作用，是廣泛rna和蛋白質(zhì)酶活性的基礎(chǔ)。在工程分子系統(tǒng)中，dna也被證明可以進行非共價催化反應，這為在化學、材料和醫(yī)學中嵌入更復雜的控制提供了潛力。例如，dna催化劑可用于分子診斷中的信號放大，并且可以與其他結(jié)構(gòu)組合以執(zhí)行各種功能，包括信號恢復和加權(quán)乘法。turberfield等人首次構(gòu)建了一種非酶催化系統(tǒng)，通過toehold啟動的鏈置換來打開環(huán)，從而提高反應速率。seelig等人改進了這一系統(tǒng)，使其更穩(wěn)定且更高效。這些系統(tǒng)中的催化劑可以被視為原型分子馬達，因為它們經(jīng)歷從單鏈dna到雙鏈dna的構(gòu)象變化，理論上這種運動可以驅(qū)動納米機器。

3、為了應對這一挑戰(zhàn)，本發(fā)明利用dna鏈置換的高特異性，開發(fā)了一種配對接頭結(jié)構(gòu)(pjs)策略，以增強dna鏈置換反應的熱力學驅(qū)動力。將兩條互補的單鏈臂插入非共價dna催化反應的底物中，以增加系統(tǒng)熵，同時盡量減少對反應速率的影響并保持低泄漏。pjs的引入使反應底物的催化反應產(chǎn)率提高，因為反應轉(zhuǎn)變?yōu)殪卦黾拥倪^程，具有更高的熱力學驅(qū)動力，更易于發(fā)生和全面進行。更重要的是，該系統(tǒng)還被用于構(gòu)建生物傳感平臺，在復雜生物環(huán)境中直接檢測凝血酶，展示了其魯棒性和靈敏性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種簡單、靈敏且特異的凝血酶檢測策略。

2、具體技術(shù)方案如下：

3、一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應用于凝血酶檢測的新方法，其檢測方法包括以下步驟：

4、(1)反應底物退火反應底物在95℃5min，以每秒0.1℃的速率下降至25℃，并保持5min，放在4℃?zhèn)溆谩?/p>

5、(2)熒光檢測流程為了檢測不同濃度的凝血酶，a部分溶液由底物1和底物2組成。b部分溶液由凝血酶適配體1、凝血酶適配體2、和te?mg2+組成。首先，將b部分溶液在室溫下孵育5分鐘。隨后，將a部分和b部分在37℃下混合，并通過rotor-gene?q實時熒光定量pcr分析儀(qiagen，德國)監(jiān)測熒光強度。

6、所述步驟(2)中底物1的濃度最好是250nm。

7、所述步驟(2)中底物2的濃度最好是250nm。

8、所述步驟(2)中適配體1的濃度最好是200nm。

9、所述步驟(2)中適配體2的濃度最好是200nm。

10、所述步驟(2)中te?mg2+的濃度最好是12.5mm/l。

11、本發(fā)明利用配對接頭結(jié)構(gòu)(pjs)策略建立了一種特異和靈敏的凝血酶檢測方法。由于凝血酶有兩種與不同表位結(jié)合的特異性適配體，并且每種適配體都由中間含有短互補序列的分裂催化劑c延伸而成，使它們能夠相互結(jié)合。其檢測原理為當靶標凝血酶與兩種適配體共存時，適配體會與凝血酶發(fā)生結(jié)合并使其發(fā)生鄰近效應，從而能形成活性重構(gòu)催化劑c，最終會觸發(fā)所構(gòu)建的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應(pjs-edcr)。對于pjs-edcr，其具體原理如下(附圖1)：對于在催化劑c作用下，c首先取代三鏈復合物(ps1_2)。隨后，f1_2通過反向toehold再次置換c，然后進行四向分支遷移，最終產(chǎn)生兩種類型的產(chǎn)物：s1f1和s2f2并出現(xiàn)顯著的熒光變化。

12、page分析首先用于驗證pjs-edcr反應過程(附圖2)。首先，在泳道6含有兩種反應底物的混合物，但并沒有觀察到新的條帶，表明pjs-edcr的兩種反應底物保持穩(wěn)定，在沒有催化劑c的情況下不會相互反應。當將c鏈添加到純s1_2底物中時，沒有出現(xiàn)新的條帶，因為沒有燃料鏈添加到反應中，循環(huán)反應沒有發(fā)生(泳道5)。在純s1_2底物中加入c鏈時，沒有出現(xiàn)新的條帶，因為反應中沒有加入燃料鏈，循環(huán)反應沒有發(fā)生。上述結(jié)果有力地證實了pjs-edcr的成功設(shè)計和可行性。

13、為了進一步分析pjs-edcr反應過程，我們進行了熒光動力學實驗驗證(附圖3)。在沒有催化劑c的情況下，空白對照系統(tǒng)的熒光強度幾乎沒有增加，這證實了pjs-edcr保持低泄漏的能力。然而，在催化劑c存在的情況下，熒光強度迅速增加，表明pjs-edcr的發(fā)生。上述結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了一種新型無酶dna電路信號放大系統(tǒng)，可以應用于凝血酶的高靈敏度和高特異性檢測。

14、在建立了凝血酶響應型pjs-edcr之后(附圖4)，我們進一步評估了傳感器對凝血酶的敏感性。在37℃下，向反應體系中加入1nm至250nm不同濃度的凝血酶1小時(附圖5)。通過實時監(jiān)測凝血酶響應型pjs-edcr，我們觀察到熒光信號與凝血酶濃度在1nm至50nm范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系((附圖6)。校準方程為y＝0.19958+0.00946x，相關(guān)系數(shù)r2為0.9914。計算得出檢測限(lod)為0.2nm。與其他凝血酶響應型的無酶dna電路信號放大系統(tǒng)相比，hear可以顯著提高靈敏度和便利性。

15、為了評估構(gòu)建的凝血酶響應型pjs-edcr實驗的特異性，我們引入一些相關(guān)蛋白(lgg、纖維蛋白原、牛血清白蛋白(bsa)、重組白蛋白(alb)和肌紅蛋白(myo))。在相同濃度下，凝血酶分子誘導的信號明顯高于其他干擾物質(zhì)或類似化合物誘導的信號(附圖7)。這證實了這種檢測方法具有令人滿意的選擇性。上述數(shù)據(jù)證明了這種設(shè)計具有出色的蛋白質(zhì)傳感性能。

16、本專利提出了一種新的強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應策略，應用于凝血酶的高靈敏度和高特異性檢測。凝血酶響應型pjs-edcr只需要兩個設(shè)計簡單的反應底物以及兩種適配體即可快速輕松地一鍋法檢測凝血酶。該方法具有高靈敏度和高特異性，測定限為0.2nm。結(jié)果表明，凝血酶響應型pjs-edcr方法在疾病診斷和生物醫(yī)學研究方面具有巨大的潛力。

技術(shù)特征：

1.一種基于發(fā)夾探針介導的指數(shù)擴增反應用于痕量核酸的靈敏特異檢測，其特征在于包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的用兩種反應底物和兩種適配體循環(huán)方法。

3.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應用于凝血酶檢測的新方法，其制備方法步驟(2)中底物1的濃度是1μμ-100nm。

4.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應用于凝血酶檢測的新方法，其制備方法步驟(2)中底物2的濃度是1μμ-100nm。

5.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應用于凝血酶檢測的新方法，其制備方法步驟(2)中適配體1的濃度是1μμ-100nm。

6.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應用于凝血酶檢測的新方法，其制備方法步驟(2)中適配體2的濃度是1μμ-100nm。

7.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動dna非共價催化反應用于凝血酶檢測的新方法，其制備方法步驟(2)中te?mg2+的濃度是50mm/l-1mm/l。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種凝血酶檢測技術(shù)，特別涉及一種基于配對接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計的增強型熵驅(qū)動DNA非共價催化反應，用于凝血酶的靈敏特異檢測。本發(fā)明通過設(shè)計靶標特異性的適配體，通過鄰位連接策略對凝血酶靶標進行識別，最終觸發(fā)增強型熵驅(qū)動DNA非共價催化反應。

技術(shù)研發(fā)人員：謝國明,王蔚韜,余紅艷
受保護的技術(shù)使用者：重慶醫(yī)科大學國際體外診斷研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19