本申請(qǐng)涉及生物工程，具體為一種納豆激酶及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、隨著人口的老齡化、人們生活方式及習(xí)慣的改變，肺血栓栓塞癥(pte)和深靜脈血栓(dvt)、急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acs)、心房顫動(dòng)、動(dòng)脈缺血發(fā)作、腦卒中等血栓栓塞性疾病成為全球性的重大健康問(wèn)題，每年約有1千萬(wàn)人因此死亡，成為導(dǎo)致全球人口死亡的第一位原因。因此世界各國(guó)都致力于研究開(kāi)發(fā)治療血栓性疾病的藥物。上世紀(jì)80年代，納豆激酶作為納豆的核心活性成分被日本學(xué)者須見(jiàn)洋行發(fā)現(xiàn)。因?yàn)樗哂腥芩ɑ钚愿?、特異性?qiáng)、來(lái)源廣泛、可口服、安全等一系列的優(yōu)點(diǎn)，得到了國(guó)內(nèi)外研究者的青睞。

2、納豆激酶是由枯草芽孢桿菌發(fā)酵而來(lái)，是一種絲氨酸蛋白酶，其是枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的胞外酶，主要存在于發(fā)酵液中。目前從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中提取納豆激酶通常先初步提取得到納豆激酶粗品，然后經(jīng)過(guò)凝膠層析、疏水層析、親和層析和離子交換層析中兩種以上的層析方法進(jìn)行進(jìn)一步純化，從而得到純的納豆激酶。而制備納豆激酶粗品通常會(huì)先采用有機(jī)溶劑沉淀或鹽析后透析脫鹽初步提取或雙水相萃取法。具體的，閻家麒在“豆豉纖溶酶的純化及其性質(zhì)研究”一文中提到了上清液中先加入硫酸銨使飽和度至25％離心除去雜蛋白，再加入硫酸銨使飽和度至60％，攪拌溶解后冷處?kù)o置過(guò)夜。然后棄上清液，離心，收集沉淀，超濾除鹽后得豆豉纖溶酶粗品。史延茂在“納豆激酶分離純化方法的研究”一文中也提到了當(dāng)硫酸銨飽和度＜20％時(shí)，大量的雜蛋白被沉淀下來(lái)而納豆激酶沒(méi)有被沉淀下來(lái)；而當(dāng)硫酸銨飽和度＞60％時(shí)，納豆激酶已基本被沉淀下來(lái)，因此選擇20％～60％的飽和度為硫酸銨二級(jí)鹽析的飽和度范圍。陸瑾在“金屬螯合雙水相親和分配技術(shù)分離納豆激酶的研究”一文中提到了利用peg、pes和無(wú)機(jī)鹽配制雙水相系統(tǒng)也可以用于納豆激酶的粗提取。

3、但現(xiàn)有的硫酸銨分步沉淀粗提納豆激酶的方法，需要兩步鹽析，兩步離心后透析脫鹽得到納豆激酶粗酶液，整個(gè)工藝過(guò)程繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且造成一定的環(huán)境污染。金屬螯合雙水相系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵液的加入量要求在10-15％，當(dāng)加入量大于20％，由于蛋白質(zhì)溶解度的限制以及雜蛋白的干擾，分配系數(shù)有較明顯下降，而發(fā)酵液的加入量小使得在工業(yè)生產(chǎn)中難以應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N納豆激酶及其制備方法，旨在提供一種新型的納豆激酶的提純制備方法，具有操作簡(jiǎn)單、工藝周期較短、濃縮倍數(shù)高、收率高的特點(diǎn)。

2、本申請(qǐng)實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，提供一種納豆激酶的制備方法，包括：提供枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的上清液；向所述上清液中加入非離子表面活性劑并混合均勻，然后加入硫酸銨并混合，靜置后收集上層的納豆激酶聚集物；將所述納豆激酶聚集物復(fù)溶于水中，調(diào)節(jié)ph為6-10后，干燥得到納豆激酶。

3、在一些實(shí)施例中，所述非離子表面活性劑包括烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚二甲基硅氧烷中的一種或多種；和/或，所述非離子表面活性劑與所述上清液的體積比小于等于1：100。

4、在一些實(shí)施例中，所述烷基酚聚氧乙烯醚包括壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基聚氧乙烯醚、二壬基酚聚氧乙烯醚中的一種或多種；和/或，所述非離子表面活性劑與所述上清液的體積比為(0.10-0.15)：100。

5、在一些實(shí)施例中，所述加入硫酸銨并混合，使混合溶液中硫酸銨的飽和度為50％-100％；和/或，所述靜置的溫度為2℃-10℃；和/或，所述靜置的時(shí)間為1h-4h。

6、在一些實(shí)施例中，使混合溶液中硫酸銨的飽和度為60％-80％；和/或，所述靜置的溫度為3℃-5℃。

7、在一些實(shí)施例中，所述納豆激酶聚集物與所述水的質(zhì)量體積比為1:3-1:4；和/或，所述將所述納豆激酶聚集物復(fù)溶于水中，調(diào)節(jié)ph為8-10；和/或，所述干燥選自噴霧干燥或冷凍干燥。

8、在一些實(shí)施例中，所述調(diào)節(jié)ph為6-10后，還包括加入保護(hù)劑的步驟；其中，所述保護(hù)劑包括麥芽糊精、海藻糖、甘露醇中的一種或多種，所述保護(hù)劑的加入量與所述上清液的質(zhì)量百分比為7％-10％。

9、在一些實(shí)施例中，所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的上清液之前，還包括：將枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，離心后得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵上清液，其中，所述枯草芽孢桿菌保藏號(hào)為cctcc?no:m2022132。

10、在一些實(shí)施例中，所述將枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，包括：將枯草芽孢桿菌種子液按照(1％-5％ml)/100ml接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分配比為：蛋白胨15.0g-30.0g，葡萄糖15.0g-30.0g，磷酸氫二鈉8.0g-12.0g，磷酸二氫鈉0.8g-1.2g，硫酸鎂0.3g-0.6g，無(wú)水氯化鈣0.15g-0.30g，聚醚改性硅消泡劑1.0g-1.5g；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)了滅菌處理，其中滅菌處理的溫度為110℃-120℃，滅菌時(shí)間30-60min；在35-40℃、溶氧20％-40％下培養(yǎng)24-48h得到所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。

11、在一些實(shí)施例中，所述調(diào)節(jié)ph為6-10后，干燥后得到納豆激酶的粗酶粉，然后使用凝膠層析、疏水層析、親和層析和離子交換層析中的兩種以上的層析方法對(duì)所述粗酶粉進(jìn)一步純化，得電泳純的納豆激酶。

12、在另一方面，本申請(qǐng)還提供一種納豆激酶，由上述納豆激酶的制備方法制得。

13、本申請(qǐng)至少包括以下有益效果：本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{豆激酶的制備方法，利用非離子表面活性劑和硫酸銨體系萃取技術(shù)，非離子表面活性劑能夠?qū){豆激酶進(jìn)行包裹，而非離子表面活性劑中疏水基支鏈的存在能夠使得納豆激酶從高濃度硫酸銨溶液中析出，通過(guò)復(fù)溶后干燥，得到納豆激酶粗酶粉。本申請(qǐng)的制備方法簡(jiǎn)單易操作，安全高效，解決了傳統(tǒng)工藝納豆激酶經(jīng)硫酸銨沉淀操作復(fù)雜，耗時(shí)久的問(wèn)題，且整個(gè)工藝流程步驟較少，耗時(shí)較短，不影響蛋白質(zhì)活性，收率高。

技術(shù)特征：

1.一種納豆激酶的制備方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述非離子表面活性劑包括烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚二甲基硅氧烷中的一種或多種；和/或，

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述加入硫酸銨并混合，使混合溶液中硫酸銨的飽和度為50％-100％；和/或，

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，使所述混合溶液中硫酸銨的飽和度為60％-80％；和/或，

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述納豆激酶聚集物與所述水的質(zhì)量體積比為1:3-1:4；和/或，

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)ph為6-10后，還包括加入保護(hù)劑的步驟；其中，所述保護(hù)劑包括麥芽糊精、海藻糖、甘露醇中的一種或多種，所述保護(hù)劑的加入量與所述上清液的質(zhì)量百分比為7％-10％。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的上清液之前，還包括：

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)ph為6-10后，干燥后得到納豆激酶的粗酶粉，然后使用凝膠層析、疏水層析、親和層析和離子交換層析中的兩種以上的層析方法對(duì)所述粗酶粉進(jìn)一步純化，得電泳純的納豆激酶。

10.一種納豆激酶，其特征在于，由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的納豆激酶的制備方法制得。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N納豆激酶及其制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域領(lǐng)域。本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{豆激酶的制備方法，利用非離子表面活性劑和硫酸銨體系萃取技術(shù)，非離子表面活性劑能夠?qū){豆激酶進(jìn)行包裹，而非離子表面活性劑中疏水基支鏈的存在能夠使得納豆激酶從高濃度硫酸銨溶液中析出，通過(guò)復(fù)溶后干燥，得到納豆激酶粗酶粉。本申請(qǐng)的制備方法簡(jiǎn)單易操作，安全高效，解決了傳統(tǒng)工藝納豆激酶經(jīng)硫酸銨沉淀操作復(fù)雜，耗時(shí)久的問(wèn)題，且整個(gè)工藝流程步驟較少，耗時(shí)較短，不影響蛋白質(zhì)活性，收率高。

技術(shù)研發(fā)人員：高雅,董艷山,王春,吳正喜,范宇鵬,王業(yè)富
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢真福創(chuàng)新生物制藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10