本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物，具體涉及ghfar3基因及其在調(diào)控棉花抗黃萎病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前威脅我國棉花生產(chǎn)最為嚴(yán)重的病害是由土壤絲狀真菌大麗輪枝菌(verticillium?dahliae)引起的棉花黃萎病(cotton?verticillium?wilt)，也被稱為棉花的“癌癥”。選育和推廣抗病新品種是防治棉花黃萎病最經(jīng)濟有效的措施。盡管育種家通過常規(guī)育種的方法選育了一批對黃萎病具有較強抗性且綜合性狀優(yōu)良的棉花品種，但由于缺乏黃萎病抗源、黃萎病菌變異快和傳統(tǒng)育種方法周期長，使得棉花抗黃萎病育種進(jìn)展緩慢。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行作物品種改良，可以快速培育具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的新品種。隨著棉花分子生物學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，運用現(xiàn)代基因工程技術(shù)，進(jìn)行棉花抗病分子育種的條件已趨于成熟。因此，開展棉花抗黃萎病分子機制研究，挖掘和鑒定抗病關(guān)鍵基因，對利用基因工程手段提高陸地棉對黃萎病抗性具有重要意義。

2、脂肪酰輔酶a還原酶(far)基因通常以基因家族的形式存在，目前在擬南芥中被鑒定出的far家族成員有8個，其中atfar1、atfar4和atfar5在根部內(nèi)胚層細(xì)胞中高表達(dá)，并且它們受創(chuàng)傷與脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)模式與木栓質(zhì)的沉積高度一致。突變體實驗發(fā)現(xiàn)，atfar1、atfar4和atfar5分別在擬南芥根中參與c22、c20和c18脂肪醇的合成(domergue?etal.2010)。而其它的far家族成員并不參與木栓質(zhì)合成。例如atfar2(atms2)是控制花粉外壁合成的重要基因，定位于質(zhì)體，通過催化c16:0-acp轉(zhuǎn)變成c16:0脂肪醇參與花粉壁絨氈層的形成；該基因的缺失會使花粉壁發(fā)育異常，導(dǎo)致擬南芥出現(xiàn)不育表型(chen?etal.2011)。atfar3在釀酒酵母中主要參與c24和c26初級脂肪醇的生物合成(rowland?anddomergue2012)。在小麥中，對far基因的功能研究主要集中在蠟質(zhì)合成方面，因為表皮蠟質(zhì)是小麥抗逆性選擇的一個重要性狀。wang等(2016a)在小麥中鑒定到了32個far基因，其中有9個在幼苗葉片中高表達(dá)；9個在旗葉中高表達(dá)；14個同時在幼苗葉片和旗葉中高表達(dá)。

3、也即，far家族基因的功能差異性較大，需要進(jìn)一步挖掘和研究棉花中的far基因，加深對棉花黃萎病抗性機制的理解，從而選育出抗病新品種。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一個正調(diào)控棉花抗黃萎病的基因ghfar3及其應(yīng)用。發(fā)明人在研究過程中創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用vigs(virus-induced?gene-silencing)方法對棉花體內(nèi)ghfar3進(jìn)行基因沉默后，使得棉花對病毒，如黃萎病等更加敏感，即ghfar3基因正向調(diào)節(jié)棉花對黃萎病病菌的抗性，提供了ghfar3基因在棉花抗病育種中的潛在應(yīng)用；同時可以應(yīng)用ghfar3基因來推測棉花株系的抗病性，從而可以用來篩選高抗病性的棉花株系。

2、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

3、一種抗黃萎病棉花基因ghfar3，所述棉花基因ghfar3的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

4、一種抗黃萎病棉花調(diào)控蛋白ghfar3，所述棉花調(diào)控蛋白ghfar3的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

5、ghfar3基因在調(diào)控棉花抗黃萎病中的應(yīng)用，所述ghfar3基因的核苷酸序列如seqid?no:1所示。

6、ghfar3蛋白在調(diào)控棉花抗黃萎病中的應(yīng)用，所述ghfar3蛋白的氨基酸序列如seqid?no:2所示。

7、所述調(diào)控的意思為低表達(dá)、不表達(dá)或者過表達(dá)。本行業(yè)技術(shù)人員可以根據(jù)需要，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)的方法去實施，以獲得不同的轉(zhuǎn)基因棉花，以滿足各種商品化的需求。

8、一種制備轉(zhuǎn)基因棉花的方法，所述方法包括：使得目標(biāo)棉花中g(shù)hfar3基因或其活性片段的表達(dá)水平與所述棉花的野生型表現(xiàn)出差異，以獲得所述轉(zhuǎn)基因棉花。

9、優(yōu)選地，所述方法包括：使得目標(biāo)棉花中低表達(dá)或者不表達(dá)所述ghfar3基因或其活性片段。

10、優(yōu)選地，所述方法包括：使得目標(biāo)棉花中過表達(dá)所述ghfar3基因或其活性片段。

11、一種抗黃萎病棉花的育種方法，所述育種方法包括使棉花中g(shù)hfar3基因的表達(dá)出現(xiàn)差異，以獲得抗黃萎病棉花。

12、一種轉(zhuǎn)基因棉花，所述轉(zhuǎn)基因棉花中g(shù)hfar3基因或其活性片段的表達(dá)水平與所述棉花的野生型的表達(dá)水平有差異。

13、一種棉花抗病性的檢測方法，所述檢測方法是檢測目標(biāo)棉花中g(shù)hfar3基因的表達(dá)量。

14、優(yōu)選地，所述檢測方法包括利用pcr(polymerase?chain?reaction，中文名是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法擴增目標(biāo)棉花中g(shù)hfar3基因。

15、優(yōu)選地，pcr所用的引物包括seq?id?no:3和/或seq?id?no:4所示的引物。

16、本行業(yè)技術(shù)人員也可以自行設(shè)計其它引物來擴增ghfar3基因，通過檢測得到的ghfar3基因的表達(dá)量。將數(shù)據(jù)與感病棉品種作對比，推測其抗病性，和/或，篩選高抗病性的棉花株系。

17、本發(fā)明的有益效果是：

18、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)黃萎病菌處理可以誘導(dǎo)ghfar3基因在棉花抗病品種中顯著表達(dá)，而在棉花感病品種中所述基因表達(dá)上調(diào)滯后或無明顯變化。后續(xù)實驗證實了ghfar3基因在抗黃萎病過程中起正調(diào)控作用，并且在ghfar3基因沉默植株中對黃萎病的抗性顯著降低，且木栓質(zhì)含量顯著降低。因此，本發(fā)明不僅為棉花抗病育種提供重要的理論支持，而且提供了一種ghfar3基因或其活性片段在棉花抗黃萎病領(lǐng)域中的用途。

19、同時可以應(yīng)用ghfar3基因來推測棉花株系的抗病性，從而可以用來篩選高抗病性的棉花株系。

技術(shù)特征：

1.一種抗黃萎病棉花基因ghfar3，其特征在于，所述棉花基因ghfar3的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

2.一種抗黃萎病棉花調(diào)控蛋白ghfar3，其特征在于，所述棉花調(diào)控蛋白ghfar3的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

3.ghfar3基因在調(diào)控棉花抗黃萎病中的應(yīng)用，其特征在于，所述ghfar3基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

4.ghfar3蛋白在調(diào)控棉花抗黃萎病中的應(yīng)用，其特征在于，所述ghfar3蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

5.一種制備轉(zhuǎn)基因棉花的方法，其特征在于，所述方法包括：使得目標(biāo)棉花中如權(quán)利要求1所述的ghfar3基因或其活性片段的表達(dá)水平與所述棉花的野生型表現(xiàn)出差異，以獲得所述轉(zhuǎn)基因棉花。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：使得目標(biāo)棉花中低表達(dá)或者不表達(dá)所述ghfar3基因或其活性片段。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：使得目標(biāo)棉花中過表達(dá)所述ghfar3基因或其活性片段。

8.一種抗黃萎病棉花的育種方法，其特征在于，所述育種方法包括使棉花中如權(quán)利要求1所述的ghfar3基因的表達(dá)出現(xiàn)差異。

9.一種轉(zhuǎn)基因棉花，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因棉花中如權(quán)利要求1所述的ghfar3基因或其活性片段的表達(dá)水平與所述棉花的野生型的表達(dá)水平有差異。

10.一種棉花抗病性的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法是檢測目標(biāo)棉花中g(shù)hfar3基因的表達(dá)量，其中g(shù)hfar3基因如權(quán)利要求1所述。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了GhFAR3基因及其在調(diào)控棉花抗黃萎病中的應(yīng)用。發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用VIGS方法對棉花體內(nèi)GhFAR3進(jìn)行基因沉默后，使得棉花對黃萎病病毒更加敏感，即GhFAR3基因正向調(diào)節(jié)棉花對黃萎病病菌的抗性，提供了GhFAR3基因在棉花抗病育種中的潛在應(yīng)用；同時可以應(yīng)用GhFAR3基因來推測棉花株系的抗病性，從而可以用來篩選高抗病性的棉花株系。

技術(shù)研發(fā)人員：孫士超,王寧,熊顯鵬,馮克云
受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10