本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及bnsnat4蛋白及其編碼基因在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、褪黑素(melatonin，mt)是一種新興的植物激素。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講，mt是一種色氨酸衍生物，化學(xué)名稱為n-乙酰-5-甲氧基色胺，是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的小分子吲哚胺類物質(zhì)。從生理功能上來說，mt與其他植物激素相似，它不僅調(diào)控種子萌發(fā)和根系構(gòu)型，也調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、光周期及生物和非生物脅迫耐性。mt不僅可以調(diào)節(jié)種子萌發(fā)、根系構(gòu)型、氣孔運(yùn)動(dòng)、生物節(jié)律和開花與衰老，還通過激活抗氧化系統(tǒng)的活力，清除活性氧(reactiveoxygen?species,ros)，從而減輕脅迫造成的氧化脅迫、滲透脅迫、蛋白變性和細(xì)胞損傷，最終使植物應(yīng)答生物和非生物脅迫。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)mt在正常生理?xiàng)l件下，其在植物體內(nèi)的含量很低，但在高溫、低溫、干旱、鹽漬、重金屬、紫外輻射和水澇等逆境脅迫下，mt的含量可增加上百倍，繼而引發(fā)mt信號(hào)，增強(qiáng)植物對(duì)這些逆境脅迫的抵抗能力。

2、褪黑素在植物體內(nèi)的合成起始于色氨酸，以5-羥色胺為中間體，最終合成褪黑素。在合成過程中，色氨酸在色氨酸脫羧酶(tdc)的催化作用下形成色胺，接著在色胺-5-羥化酶(t5h)催化下將色胺轉(zhuǎn)化成5-羥色胺，5-羥色胺通過5-羥色胺-n-乙?；D(zhuǎn)移酶(snat)被乙?；蒼-乙?；?5-羥色胺，隨即被n-乙?；?5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶(asmt)和咖啡酸-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(comt)催化合成褪黑素。此外，5-羥色胺也可以先被asmt/comt催化為5-甲氧基色胺，之后再在snat的作用下合成褪黑素。

3、目前，在褪黑素對(duì)油菜的影響的研究中，均為使用外源褪黑素，對(duì)于油菜內(nèi)源褪黑素的合成以及關(guān)鍵酶的研究存在空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于油菜合成褪黑素關(guān)鍵酶的研究空白，本發(fā)明提供了bnsnat4蛋白及其編碼基因在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，具體技術(shù)方案如下：

2、第一方面，本發(fā)明提供了bnsnat4蛋白在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3、第二方面，本發(fā)明提供了bnsnat4基因在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4、本發(fā)明中通過對(duì)snat家族基因的鑒定，并進(jìn)行蛋白中是否存在gnat結(jié)構(gòu)域和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽這兩種結(jié)構(gòu)的篩選，最終篩選得到bnpir中基因號(hào)為bnac04t0550700we的基因，確認(rèn)其表達(dá)產(chǎn)物具有將5-羥色胺催化為n-乙?；?5-羥色胺的功能，將該表達(dá)產(chǎn)物命名為bnsnat4蛋白。

5、第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，所述重組載體包含有bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq?idno.2所示。

6、第四方面，本發(fā)明提供了一種基因工程菌在催化5-羥色胺合成n-乙酰基-5-羥色胺中的應(yīng)用，所述基因工程菌包含bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq?idno.2所示。

7、第五方面，本發(fā)明提供了一種n-乙酰基-5-羥色胺的生產(chǎn)方法，包括：在乙?；w存在的情況下，以5-羥色胺為底物，利用催化劑催化合成n-乙?；?5-羥色胺；

8、所述催化劑為bnsnat4蛋白或其固定化酶，或者含bnsnat4基因的基因工程菌，或者所述基因工程菌發(fā)酵后的粗酶液或濕菌體；

9、所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

10、進(jìn)一步地，所述乙?；w為乙酰輔酶a。

11、進(jìn)一步地，所述乙酰輔酶a與5-羥色胺的摩爾比為1：1。

12、第六方面，本發(fā)明提供了bnsnat4蛋白在促進(jìn)油菜植株n-乙酰基-5-羥色胺合成中的應(yīng)用，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

13、第七方面，bnsnat4蛋白在促進(jìn)油菜植株褪黑素合成中的應(yīng)用，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

14、目前，在油菜體內(nèi)還未鑒定到snat基因，而本發(fā)明篩選得到的bnsnat4基因其表達(dá)產(chǎn)物具有將5-羥色胺催化生成n-乙?；?5-羥色胺的作用，可以參與油菜體內(nèi)n-乙酰基-5-羥色胺合成的進(jìn)程，以幫助油菜合成褪黑素。

15、進(jìn)一步地，在油菜植株褪黑素合成中，5-羥色胺在bnsnat4蛋白的催化作用下生成n-乙?；?5-羥色胺。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

17、本發(fā)明在油菜中鑒定得到一種新的5-羥色胺-n-乙?；D(zhuǎn)移酶bnsnat4蛋白，其由bnpir庫中基因號(hào)為bnac04t0550700we的基因編碼，經(jīng)過驗(yàn)證bnsnat4蛋白可以將5-羥色胺催化為n-乙?；?5-羥色胺。油菜中bnsnat4蛋白的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了油菜合成褪黑素關(guān)鍵酶的研究空白，并且對(duì)于褪黑素的內(nèi)源合成研究以及snat家族種類的進(jìn)一步研究具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.bnsnat4蛋白在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，其特征在于，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.bnsnat4基因在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，其特征在于，所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種重組載體在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，其特征在于，所述重組載體包含有bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4.一種基因工程菌在催化5-羥色胺合成n-乙?；?5-羥色胺中的應(yīng)用，其特征在于，所述基因工程菌包含bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5.一種n-乙酰基-5-羥色胺的生產(chǎn)方法，其特征在于，在乙?；w存在的情況下，以5-羥色胺為底物，利用催化劑催化合成n-乙?；?5-羥色胺；

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述乙?；w為乙酰輔酶a。

7.bnsnat4蛋白在促進(jìn)油菜植株n-乙?；?5-羥色胺合成中的應(yīng)用，其特征在于，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

8.bnsnat4蛋白在促進(jìn)油菜植株褪黑素合成中的應(yīng)用，其特征在于，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，油菜植株褪黑素合成中，5-羥色胺在bnsnat4蛋白的催化作用下生成n-乙?；?5-羥色胺。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及BnSNAT4蛋白及其編碼基因在催化5?羥色胺合成N?乙?；?5?羥色胺中的應(yīng)用，所述BnSNAT4蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明在油菜中鑒定得到一種新的5?羥色胺?N?乙酰基轉(zhuǎn)移酶BnSNAT4蛋白，其由BnPIR庫中基因號(hào)為BnaC04T0550700WE的基因編碼。經(jīng)過驗(yàn)證，BnSNAT4蛋白可以將油菜體內(nèi)的5?羥色胺催化為N?乙?；?5?羥色胺。油菜中BnSNAT4蛋白的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了油菜合成褪黑素關(guān)鍵酶的研究空白，并且對(duì)于褪黑素的內(nèi)源合成研究以及SNAT家族種類的進(jìn)一步研究具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：郭小浩,董杰,蓋小斌,譚瑗瑗,舒慶堯
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10