本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，具體涉及一種基于神經(jīng)纖維特異性熒光的神經(jīng)再生研究方法。

背景技術(shù)：

1、神經(jīng)包括脊髓和周圍神經(jīng)。脊髓(spinal?cord)位于脊柱的內(nèi)且被脊椎保護(hù)；是源自腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)延伸部分。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞依靠復(fù)雜的聯(lián)系來處理傳遞信息。脊髓主要負(fù)責(zé)軀干和四肢的反射動作，及傳送腦與外周之間的神經(jīng)信息。周圍神經(jīng)是指腦和脊髓以外的所有神經(jīng)，包括神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)干、神經(jīng)叢及神經(jīng)終末裝置；周圍神經(jīng)可根據(jù)連于中樞的部位不同分為連于腦的腦神經(jīng)和連于脊髓的脊神經(jīng)。神經(jīng)元胞質(zhì)(胞漿)的延長部分稱為“神經(jīng)纖維”，也叫“突起”。

2、然而神經(jīng)按照損傷程度的不同可分為以下幾種：神經(jīng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)功能傳導(dǎo)暫時發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)纖維不退行性變，臨床表現(xiàn)為運(yùn)動障礙且無肌萎縮，疼痛持續(xù)，不消失，功能可在幾天或幾周內(nèi)自行恢復(fù)，無后遺癥；神經(jīng)軸索中斷神經(jīng)受鈍性損傷或持續(xù)壓迫，軸索斷裂導(dǎo)致遠(yuǎn)端軸索和髓鞘變性，神經(jīng)內(nèi)膜管完整，軸索可沿萬鞘管生長至末端，臨床表現(xiàn)為神經(jīng)分布運(yùn)動、感覺功能喪失、肌萎縮和營養(yǎng)變化的結(jié)束，大多情況可自行恢復(fù)，在嚴(yán)重情況下，神經(jīng)內(nèi)疤痕形成需要神經(jīng)松解；而神經(jīng)完全斷裂，神經(jīng)功能完全喪失，需要手術(shù)修復(fù)才能恢復(fù)功能。

3、神經(jīng)損傷修復(fù)后，需對再生神經(jīng)組織進(jìn)行可視化檢測。傳統(tǒng)的再生神經(jīng)可視化檢測方法包括切片觀察和基于熒光標(biāo)記物抗體的檢測。其中石蠟切片/冰凍切片(5-25μm薄片)與免疫組織化學(xué)熒光，這種方案通常會消耗研究人員大量的精力，且薄片難以重構(gòu)三維組織，最終效果差強(qiáng)人意，無法完整的反映整個器官維度再生的情況。另一種方法是在整個再生神經(jīng)組織中組織透明化結(jié)合標(biāo)記預(yù)先連接熒光標(biāo)記物的抗體，由于抗體滲透效率有限，這種方法標(biāo)記的組織深度低、特異性差，同時，此技術(shù)需用到預(yù)先連接熒光基團(tuán)的一抗進(jìn)行孵育，以避免重復(fù)孵育熒光二抗帶來的難以洗脫的非特異性熒光，因此限制了抗體標(biāo)記物的選擇，市面上僅幾種常用的預(yù)偶聯(lián)抗體可供使用，且價格昂貴。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于神經(jīng)纖維特異性熒光的神經(jīng)再生研究方法，不僅實現(xiàn)特異性神經(jīng)軸突熒光信號，而且基于所述熒光信號對再生神經(jīng)組織實現(xiàn)三維立體成像，可全面準(zhǔn)確的評估神經(jīng)修復(fù)手段的有效性。

2、本發(fā)明提供了一種基于神經(jīng)纖維特異性熒光的神經(jīng)再生評估方法，包括以下步驟：

3、將熒光蛋白編碼基因插入動物基因組nefh基因啟動子后，構(gòu)建得到表達(dá)熒光蛋白的動物；

4、對所述表達(dá)熒光蛋白的動物進(jìn)行神經(jīng)損傷造模，經(jīng)修復(fù)再生，得到神經(jīng)再生的動物；

5、從所述神經(jīng)再生的動物中取再生神經(jīng)組織固定，將再生神經(jīng)組織透明化處理，得到預(yù)處理材料；

6、將所述預(yù)處理材料進(jìn)行生物熒光三維成像，得到再生神經(jīng)組織三維立體圖。

7、優(yōu)選的，所述表達(dá)熒光蛋白的動物的構(gòu)建方法包括構(gòu)建表達(dá)熒光蛋白的重組donor載體；

8、將所述重組donor載體顯微注射至所述受精卵的細(xì)胞核中，得到重組受精卵；

9、將所述重組受精卵經(jīng)胚胎移植至動物中，經(jīng)飼養(yǎng)和產(chǎn)仔，得到表達(dá)熒光蛋白的f0動物；

10、將所述表達(dá)熒光蛋白的f0動物經(jīng)交配和傳代，得到表達(dá)熒光蛋白的純合子后代動物。

11、優(yōu)選的，所述熒光蛋白包括以下至少一種：綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和橙色熒光蛋白。

12、優(yōu)選的，所述重組donor載體的核苷酸序列如seq?id?no：1和seq?id?no：2串聯(lián)得到。

13、優(yōu)選的，所述表達(dá)熒光蛋白的動物還包括pcr鑒定；

14、所述pcr鑒定用引物包括引物對1和引物對2；

15、所述引物對1包括核苷酸序列如seq?id?no：3所示的正向引物和核苷酸序列如seqid?no：4所示的反向引物；

16、所述和引物對2包括核苷酸序列如seq?id?no：5所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no：6所示的反向引物。

17、優(yōu)選的，所述表達(dá)熒光蛋白的動物包括表達(dá)熒光蛋白的純合子動物和/或表達(dá)熒光蛋白的雜合子動物。

18、優(yōu)選的，從所述神經(jīng)再生的動物中取再生神經(jīng)組織固定的方法為用多聚甲醛灌注所述動物后，顯微境下剝離皮膚、肌肉和骨性組織，取材再生神經(jīng)置于多聚甲醛中固定。

19、優(yōu)選的，所述神經(jīng)包括脊髓和/或坐骨神經(jīng)。

20、優(yōu)選的，所述生物熒光三維成像的方法，用激光共聚焦顯微境對所述預(yù)處理材料進(jìn)行z軸多層掃描，再用zen軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行三維重構(gòu)，得到神經(jīng)再生圖。

21、優(yōu)選的，所述動物包括小鼠。

22、本發(fā)明提供了一種基于神經(jīng)纖維特異性熒光的神經(jīng)再生評估方法，包括以下步驟：將熒光蛋白編碼基因插入動物基因組nefh基因啟動子后，構(gòu)建得到表達(dá)熒光蛋白的動物；對所述表達(dá)熒光蛋白的動物進(jìn)行神經(jīng)損傷造模，經(jīng)恢復(fù)生長，得到神經(jīng)再生的動物；從所述神經(jīng)再生的動物中取再生神經(jīng)組織固定，將再生神經(jīng)組織透明化處理，得到預(yù)處理材料；將所述預(yù)處理材料進(jìn)行生物熒光三維成像，得到再生神經(jīng)組織三維立體圖。本發(fā)明以熒光蛋白作為報告蛋白插入動物基因組nefh基因啟動子后，從而賦予了小鼠優(yōu)異的神經(jīng)纖維/軸突特異熒光性能。以神經(jīng)纖維特異性表達(dá)熒光的動物為研究對象進(jìn)行神經(jīng)損傷造模，經(jīng)過神經(jīng)恢復(fù)后，從研究對象中取材再生神經(jīng)固定并組織透明化，從而保證再生神經(jīng)組織深度成像。以組織透明化處理的再生神經(jīng)進(jìn)行生物熒光三維成像，由于熒光信號特異性在神經(jīng)軸突處顯示，使再生神經(jīng)組織能夠?qū)崿F(xiàn)立體重構(gòu)，重現(xiàn)完整的神經(jīng)再生圖景，從而判斷再生神經(jīng)的結(jié)構(gòu)是否恢復(fù)如初，從而評估神經(jīng)恢復(fù)方法的有效性?？梢姡景l(fā)明提供的方法，既避免了組織切片帶來的繁冗復(fù)雜的工作量及免疫組織化學(xué)熒光帶來的非特異性熒光干擾，又能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)組織的任意部分的再生研究，且不受試劑限制，為再生醫(yī)學(xué)研究者提供更加全面的技術(shù)方案，為神經(jīng)疾病臨床治療提供了良好研究手段。

技術(shù)特征：

1.一種基于神經(jīng)纖維特異性熒光的神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述表達(dá)熒光蛋白的動物的構(gòu)建方法包括構(gòu)建表達(dá)熒光蛋白的重組donor載體；

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述熒光蛋白包括以下至少一種：綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和橙色熒光蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述重組donor載體的核苷酸序列如seq?id?no:1和seq?id?no:2串聯(lián)得到。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述表達(dá)熒光蛋白的動物還包括pcr鑒定；

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述表達(dá)熒光蛋白的動物包括表達(dá)熒光蛋白的純合子動物和/或表達(dá)熒光蛋白的雜合子動物。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，從所述神經(jīng)再生的動物中取再生神經(jīng)組織固定的方法為用多聚甲醛灌注所述動物后，顯微境下剝離皮膚、肌肉和骨性組織，取材再生神經(jīng)置于多聚甲醛中固定。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述神經(jīng)包括脊髓和/或坐骨神經(jīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述生物熒光三維成像的方法，用激光共聚焦顯微境對所述預(yù)處理材料進(jìn)行z軸多層掃描，再用zen軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行三維重構(gòu)，得到神經(jīng)再生圖。

10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、6、7和9中任意一項所述神經(jīng)再生評估方法，其特征在于，所述動物包括小鼠。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于神經(jīng)纖維特異性熒光的神經(jīng)再生研究方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。一種基于神經(jīng)纖維特異性熒光的神經(jīng)再生評估方法，將熒光蛋白編碼基因插入動物基因組Nefh基因啟動子后，構(gòu)建得到表達(dá)熒光蛋白的動物；對所述表達(dá)熒光蛋白的動物進(jìn)行神經(jīng)損傷造模，經(jīng)修復(fù)生長，得到神經(jīng)再生的動物；從所述神經(jīng)再生的動物中取再生神經(jīng)組織固定，將再生神經(jīng)組織透明化處理，將預(yù)處理材料進(jìn)行生物熒光三維成像，得到再生神經(jīng)組織三維立體圖。本發(fā)明提供的方法能夠特異性的顯示神經(jīng)軸突熒光信號，避免了組織切片帶來的繁冗復(fù)雜的工作量及免疫組織化學(xué)熒光帶來的非特異性熒光干擾，為再生醫(yī)學(xué)研究者提供更加全面的實驗方案。

技術(shù)研發(fā)人員：孫佳慧,鄒劍龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東省婦幼保健院（廣東省婦產(chǎn)醫(yī)院、廣東省兒童醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/18