本發(fā)明屬于植物生物，涉及薄殼山核桃cinf-yb18基因及其在調(diào)控植物種子發(fā)育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、薄殼山核桃(carya?illinoinensis(wangenh.)k.koch)是胡桃科山核桃屬木本植物，其富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)和酚類等營養(yǎng)物質(zhì)，具有預(yù)防心腦血管疾病和抗氧化等保健功效。與同屬的山核桃(carya?cathayensis)相比，薄殼山核桃因其果大、殼薄、味美、易取仁等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到消費(fèi)者的喜愛，在我國具有廣闊的消費(fèi)前景。然而我國薄殼山核桃年產(chǎn)量不足，國內(nèi)市場缺口大，其主要原因一是由于我國前期一直通過實(shí)生苗引種，導(dǎo)致薄殼山核桃生長期長、結(jié)果遲、栽培品種良莠不齊，二是薄殼山核桃屬于異花授粉植物，栽培過程中未進(jìn)行品種配置或者配置不合理，易造成花期不遇，導(dǎo)致生理性落果嚴(yán)重。

2、核因子y(nuclear?factor?y，nf-y)，又被稱為ccaat-box結(jié)合因子(ccaat-binding?factor，cbf)或血紅素激活蛋白(heme?activator?proteins，hap)，主要通過特異性識(shí)別和結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)ccaat-box順式作用元件來調(diào)控下游基因表達(dá)，并且廣泛存在于真菌、動(dòng)物和植物中。ccaat-box作為普遍存在的啟動(dòng)子元件，存在于約1/3的真核生物啟動(dòng)子區(qū)域，能與許多dna結(jié)合蛋白ctf/nf1、c/ebp等產(chǎn)生聯(lián)系，并起雙向調(diào)控作用。

3、在植物中對(duì)nf-y轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控種子發(fā)育過程的初步認(rèn)識(shí)來自于對(duì)胚胎發(fā)生到種子成熟過程起作用的關(guān)鍵調(diào)控因子lec1(atnf-yb9)，在油菜中過表達(dá)或下調(diào)bnlec1的表達(dá)均能夠影響油菜的產(chǎn)油量和質(zhì)量。在玉米種，過表達(dá)zmlec1會(huì)使種子含油量增加，并且通過aba途徑調(diào)控胚胎伸長。水稻中，nf-y轉(zhuǎn)錄因子同樣對(duì)種子發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)積累有著重要的調(diào)控作用。osnf-yb9是lec1的同源蛋白，能與osbzip76相互作用，通過調(diào)控細(xì)胞化來調(diào)節(jié)水稻胚乳發(fā)育過程。nf-y轉(zhuǎn)錄因子除了影響種子發(fā)育過程，也參與開花調(diào)控。擬南芥中，atnf-yc3/4/9與atabf3/4相互作用，在干旱條件下通過誘導(dǎo)soc1轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)開花，從而有助于植物在干旱脅迫下完成生命周期，適應(yīng)干旱。尚未有報(bào)道關(guān)于薄殼山核桃cinf-yb18基因功能的研究。

4、薄殼山核桃果實(shí)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到翻譯后修飾和轉(zhuǎn)錄因子等多種因素的調(diào)控。研究表明，蛋白磷酸化和nf-y轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控果實(shí)形態(tài)和產(chǎn)量方面起著重要的調(diào)控作用。因此，本申請(qǐng)從薄殼山核桃磷酸化蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)中挖掘出一個(gè)潛在調(diào)控果實(shí)發(fā)育的核因子y，通過分子手段初步揭示cinf-yb18基因調(diào)控薄殼山核桃果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)制，為提高薄殼山核桃產(chǎn)量和品種改良等提供分子基礎(chǔ)，從而推動(dòng)薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了薄殼山核桃cinf-yb18基因及其在調(diào)控植物種子發(fā)育中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了一種薄殼山核桃cinf-yb18基因，該基因具有seq?id?no:1所示的核苷酸序列，或者對(duì)所述序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。優(yōu)選情況下，該薄殼山核桃cinf-yb18基因的核苷酸序列為seq?id?no：1。

3、本發(fā)明還提供了該薄殼山核桃cinf-yb18基因編碼的蛋白，該蛋白由seq?id?no.2所示的氨基酸組成。

4、本發(fā)明還提供了含有該薄殼山核桃cinf-yb18基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

5、本發(fā)明還提供了一種調(diào)控植物種子發(fā)育的方法，該方法制備含有薄殼山核桃cinf-yb18基因的修飾植物，相對(duì)于野生型植物，所述修飾植物中，cinf-yb18基因的表達(dá)減少/增加；其中，所述cinf-yb18基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。需要說明的是，“表達(dá)減少”的概念中，“表達(dá)”是指是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程；上述過程的強(qiáng)度減少即為表達(dá)減少，具體地，可以為轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物和翻譯得到的產(chǎn)物減少。“表達(dá)增加”的概念中，“表達(dá)”是指基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程；上述過程的強(qiáng)度增加即為表達(dá)增加，具體地，可以為轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物和翻譯得到的產(chǎn)物增加。

6、在一個(gè)實(shí)施方案中，該植物為擬南芥或者薄殼山核桃。

7、本發(fā)明還提供了薄殼山核桃cinf-yb18基因在調(diào)控植物種子發(fā)育中的應(yīng)用，該應(yīng)用包括制備含有薄殼山核桃cinf-yb18基因的修飾植物，相對(duì)于野生型植物，該修飾植物中，cinf-yb18基因的表達(dá)減少/增加；其中，該cinf-yb18基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。需要說明的是，“表達(dá)減少”的概念中，“表達(dá)”是指是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程；上述過程的強(qiáng)度減少即為表達(dá)減少，具體地，可以為轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物和翻譯得到的產(chǎn)物減少?！氨磉_(dá)增加”的概念中，“表達(dá)”是指是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程；上述過程的強(qiáng)度增加即為表達(dá)增加，具體地，可以為轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物和翻譯得到的產(chǎn)物增加。

8、在一個(gè)實(shí)施方案中，將薄殼山核桃cinf-yb18基因轉(zhuǎn)入植物基因組中，并在轉(zhuǎn)基因植物中超量表達(dá)，該轉(zhuǎn)基因的植物的種子變大。

9、在一個(gè)實(shí)施方案中，該植物為擬南芥或薄殼山核桃。優(yōu)選情況下，該植物為擬南芥。

10、在一個(gè)實(shí)施方案中，該應(yīng)用包括將cinf-yb18基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到擬南芥、篩選、培養(yǎng)和獲得轉(zhuǎn)基因株系。

11、本申請(qǐng)通過克隆薄殼山核桃cinf-yb18基因，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有薄殼山核桃cinf-yb18基因的載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明：在擬南芥中過表達(dá)cinf-yb18基因?qū)е缕溟_花時(shí)間延遲、蓮座葉變大變多，成熟種子變大及千粒重增加。cinf-yb18基因主要定位在細(xì)胞核中，磷酸化位點(diǎn)突變并未改變亞細(xì)胞定位情況，且不具有轉(zhuǎn)錄激活活性，表明cinf-yb18基因可能需要與其他nf-y亞基形成復(fù)合物去行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。酵母雙雜實(shí)驗(yàn)揭示了cinf-yb18基因的互作結(jié)構(gòu)域和形成異源三聚體的作用機(jī)制，且磷酸化位點(diǎn)突變使得cinf-yb18基因與cinf-yc1/3/5/8/10的蛋白互作關(guān)系更特異。本發(fā)明有望為薄殼山核桃的果實(shí)大小調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)量調(diào)控提供研究基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種薄殼山核桃cinf-yb18基因，其特征在于，該基因具有seq?id?no:1所示的核苷酸序列，或者對(duì)所述序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因，其特征在于，所述薄殼山核桃cinf-yb18基因的核苷酸序列為seq?id?no：1。

3.權(quán)利要求1或2所述基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白由seq?id?no.2所示的氨基酸組成。

4.含有權(quán)利要求2中所述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

5.一種調(diào)控植物種子發(fā)育的方法，其特征在于，制備含有薄殼山核桃cinf-yb18基因的修飾植物，相對(duì)于野生型植物，所述修飾植物中，cinf-yb18基因的表達(dá)減少/增加；其中，所述cinf-yb18基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述植物為擬南芥或者薄殼山核桃。

7.薄殼山核桃cinf-yb18基因在調(diào)控植物種子發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，制備含有薄殼山核桃cinf-yb18基因的修飾植物，相對(duì)于野生型植物，所述修飾植物中，cinf-yb18基因的表達(dá)減少/增加；其中，所述cinf-yb18基因的堿基序列如seq?id?no：1所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，將所述基因轉(zhuǎn)入植物基因組中，并在轉(zhuǎn)基因植物中超量表達(dá)，所述轉(zhuǎn)基因的植物的種子變大。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于，所述植物為擬南芥或者薄殼山核桃。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用包括將cinf-yb18基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到擬南芥、篩選、培養(yǎng)和獲得轉(zhuǎn)基因株系。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)公開了薄殼山核桃CiNF?YB18基因，該基因具有SEQ?ID?No:1所示的核苷酸序列，或者對(duì)該序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。本申請(qǐng)還公開了一種調(diào)控植物種子發(fā)育的方法，本申請(qǐng)還公開了一種薄殼山核桃CiNF?YB18基因在調(diào)控植物種子發(fā)育中的應(yīng)用。本申請(qǐng)通過克隆薄殼山核桃CiNF?YB18基因，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有薄殼山核桃CiNF?YB18基因的載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明：在擬南芥中過表達(dá)CiNF?YB18基因?qū)е缕溟_花時(shí)間延遲、蓮座葉變大變多，成熟種子變大及千粒重增加。

技術(shù)研發(fā)人員：楊正福,汪佳妮,高楠,王正加,林楗仁
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/2