本發(fā)明涉及單細胞測序，特別是涉及一種單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒及其使用方法。

背景技術：

1、高通量單細胞測序技術在當今生物醫(yī)學研究中占據重要位置。但無論是基于哪種技術的單細胞測序技術，都需要試劑盒和儀器的配套使用。然而，它的市場推廣和廣泛應用對設備的性能和穩(wěn)定性提出了更高要求?，F有的儀器生產過程，除了中間過程檢測等步驟，對儀器本身性能的檢測外，通常需要使用真實試劑，完成完整的實驗流程，進行反復測試，以驗證儀器與試劑的配合上的各項性能。而這不僅耗費大量資源，而且增加了驗證成本和時間。此外，在生產前期，對設備的驗證過程高昂的成本也阻礙了許多小型設備制造商的發(fā)展，因此，尋找一種能夠模擬真實實驗環(huán)境且具有高效性和經濟性的模擬試劑盒就顯得尤為重要。

技術實現思路

1、鑒于以上所述現有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒及其使用方法，用于解決現有單細胞測序儀器驗證采用真實試劑盒耗費大量資源，加大驗證成本和驗證時間的問題。

2、為實現上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供一種單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，包括模擬微球、模擬細胞相、模擬反轉錄試劑和模擬液滴生成油，所述模擬微球不含有捕獲寡聚核苷酸（以下簡稱oligo），所述模擬反轉錄試劑中不含有活性酶，所述模擬細胞相中不含有細胞。

3、現有技術中，真實的單細胞測序儀器驗證試劑盒中含有特殊修飾的捕獲寡聚核苷酸、活性酶，為了測試數據的準確度，必須保證上述組分的結構穩(wěn)定和活性，上述物質一般需要在-80或-20℃下儲存，對儲存環(huán)境要求較高；同時為了保證細胞活性，試劑盒需要在4℃冰上化凍使用。本申請?zhí)岢龅膯渭毎麥y序儀器驗證模擬試劑盒，模擬微球不含有捕獲寡聚核苷酸，模擬反轉錄試劑中不含有活性酶，另外，模擬細胞相中不含有細胞，因此可以實現室溫下儲存和使用。

4、oligo即寡核苷酸鏈，分子實驗室常用的pcr引物、ngs捕獲探針、qpcr探針和fish探針等都是寡核苷酸。除了引物探針以外，還可作為核酸藥物用于遺傳疾病、腫瘤、病毒感染和感覺器官等疾病的治療或預防。作為優(yōu)選，所述模擬微球為不含有捕獲寡聚核苷酸的水凝膠微球。

5、作為優(yōu)選，所述水凝膠微球的粒徑通常在幾微米到幾百微米范圍內，粒徑均一，如5μm~800mm。

6、作為優(yōu)選，所述模擬細胞相由以下質量百分含量的組分組成：75~85%的磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate?buffered?saline，以下簡稱pbs），10~20%的密度梯度培養(yǎng)基（optiprep，以下簡稱opt）和2~5%的聚乙二醇。

7、作為優(yōu)選，所述模擬反轉錄試劑包括模擬反轉錄引物、模擬反轉錄緩沖液和模擬反轉錄酶混合液。

8、作為優(yōu)選，所述模擬反轉錄引物為濃度為10~15?mm的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽（?tris-hcl）和濃度為0.1~0.2?mm的?edta的混合物。

9、作為優(yōu)選，所述模擬反轉錄緩沖液包括以下組分：75~100mm?ph為8.?3的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽（tris-hcl），150~200mm?kcl，5~7mm?mgcl2，20~25mm?dtt，0.1~0.25vol?%非離子表面活性劑和2~5mmdntp?mix溶液。其中，0.1~0.25?vol?%非離子表面活性劑指的是非離子表面活性劑在模擬反轉錄緩沖液中的體積分數為0.1~0.25?vol?%。

10、更優(yōu)選地，所述dntp?mix溶液是datp，dctp，?dgtp?和dttp等摩爾核酸混合液，每一種核酸溶液的終濃度為25?mm。

11、更優(yōu)選地，所述模擬反轉錄酶混合液包括以下組分：10~15mm?edta；30~40mmnacl，15~20mm?ph為7.5的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽tris-hcl，5?~10mm?ph為8.0的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽tris-hcl，0.003~0.05?vol?%?非離子表面活性劑，?3~5mm?dtt，30~55?vol?%?甘油，10~15mm?kcl，20~30?vol?%聚乙二醇。作為優(yōu)選，所述聚乙二醇優(yōu)選為peg600。

12、更優(yōu)選地，所述非離子表面活性劑為ca630。

13、本發(fā)明通過添加peg600、甘油增稠劑和調節(jié)液體成分，實現與真實試劑相近的密度；通過添加peg600、甘油黏稠劑，使試劑在使用過程中表現出與真實試劑近似的粘度；通過添加非離子表面活性劑ca630這個關鍵成分保證在測序過程中與真實試劑相似的化學反應特性。

14、作為優(yōu)選，所述模擬液滴生成油為氟化表面活性劑，具體可采用hfe7500氟化油。

15、以氟化液hfe-7500作為基底油，和礦物油相比，具有低粘度、與pdms相容性好、低液滴間遷移、良好的氣體溶解性、長期生物相容性等優(yōu)點。此外，氟化表面活性劑對于油水界面的穩(wěn)定有良好效果，使用本產品制備的液滴可穩(wěn)定存放數周。

16、本申請還提供給了一種單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒用于驗證單細胞測序儀器的用途。

17、本申請還提供了一種單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒的使用方法，配套高通量單細胞儀器使用，包括以下步驟：將上述單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒的各組分加入到高通量單細胞儀器的芯片中，運行所述高通量單細胞儀器，對運行結果進行質檢。

18、如上所述，本發(fā)明的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒及其使用方法，具有以下有益效果：

19、（1）提供了一種用于高通量單細胞測序儀器生產驗證的模擬試劑盒，該試劑盒能夠在物理和化學性質上高度仿真真實試劑，確保在驗證過程中達到與實際使用環(huán)境相符的測試效果，從而降低驗證成本并提高驗證效率；

20、（2）提供了一種可以室溫儲存的模擬試劑盒，即區(qū)別于真實實驗試劑常常需要低溫保存、不易運輸的特質，本試劑盒的常溫保存和運輸大大降低了成本，也是一種客戶可以用于練手的試劑盒；

21、（3）本試劑盒的使用操作簡單，相較于真實試劑盒中繁復的試劑組分，模擬試劑盒通過試劑性能選擇、測試后，將可以合并的試劑放置于同一試劑管中；縮短了驗證時間，提高了驗證效率，使得生物技能薄弱的相關人員經過簡單培訓后，也能熟練使用本試劑盒。

技術特征：

1.一種單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于，包括模擬微球、模擬細胞相、模擬反轉錄試劑和模擬液滴生成油，所述模擬微球不含有捕獲寡聚核苷酸，所述模擬反轉錄試劑中不含有活性酶，所述模擬細胞相中不含有細胞。

2.根據權利要求1所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于：所述模擬微球為不含有捕獲寡聚核苷酸的水凝膠微球。

3.根據權利要求1所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于：所述模擬細胞相由以下質量百分含量的組分組成：75~85%的磷酸鹽緩沖鹽水，10~20%的密度梯度培養(yǎng)基和2~5%的聚乙二醇。

4.根據權利要求1所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于：所述模擬反轉錄試劑包括模擬反轉錄引物、模擬反轉錄緩沖液和模擬反轉錄酶混合液。

5.根據權利要求4所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于：所述模擬反轉錄引物為濃度為10~15?mm的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽和濃度為0.1~0.2?mm的edta的混合物。

6.根據權利要求4所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于：模擬反轉錄緩沖液包括以下組分：75~100mm?ph為8.3的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽，150~200mm?kcl，5~7mm?mgcl2，20~25mm?dtt，0.1~0.25vol%非離子表面活性劑和2~5mm?dntp?mix溶液。

7.根據權利要求4所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于：所述模擬反轉錄酶混合液包括以下組分：10~15mm?edta；30~40mm?nacl，15~20mm?ph為7.5的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽，5~10mm?ph為8.0的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽，0.003~0.05vol%?非離子表面活性劑，3~5mm?dtt，30~55vol%甘油，10~15mm?kcl，20~30vol%聚乙二醇。

8.根據權利要求1所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒，其特征在于：所述模擬液滴生成油為氟化表面活性劑。

9.一種如權利要求1~8任意一項所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒用于驗證單細胞測序儀器的用途。

10.一種如權利要求1~8任意一項所述的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒的使用方法，其特征在于：配套高通量單細胞儀器使用，包括以下步驟：將單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒的各組分加入到高通量單細胞儀器的芯片中，運行所述高通量單細胞儀器，對運行結果進行質檢。

技術總結
本發(fā)明提供一種單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒及其使用方法，所述單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒包括模擬微球、模擬細胞相、模擬反轉錄試劑和模擬液滴生成油，所述模擬微球不含有捕獲寡聚核苷酸，所述模擬反轉錄試劑中不含有活性酶，所述模擬細胞相中不含有細胞。本發(fā)明的單細胞測序儀器驗證模擬試劑盒能夠在物理和化學性質上高度仿真真實試劑，確保在驗證過程中達到與實際使用環(huán)境相符的測試效果，從而降低驗證成本并提高驗證效率。

技術研發(fā)人員：湯王鋆,丁燕芬,吳琳琳,姚佳昕
受保護的技術使用者：墨卓生物科技（浙江）有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/11/11