本申請(qǐng)涉及生物，特別是涉及一種靶向plaa基因的核酸產(chǎn)品、基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、神經(jīng)發(fā)育障礙疾病可引起全面發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇、孤獨(dú)癥譜系等多種致畸致殘表型，且起病早，無有效治愈方法，嚴(yán)重影響人口素質(zhì)，其發(fā)病機(jī)理和治療方案的研究是當(dāng)前神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

2、plaa基因突變可導(dǎo)致伴進(jìn)行性小頭畸形、痙攣和腦部異常的神經(jīng)發(fā)育障礙（neurodevelopmental?disorder?with?progressive?microcephaly,?spasticity,?andbrain?anomalies，ndmsba），為常染色體隱性遺傳。plaa基因相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙目前已有多個(gè)家系報(bào)道，患者均在生命早期出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育障礙（出生1天至4個(gè)月），表現(xiàn)出生長遲滯、認(rèn)知與運(yùn)動(dòng)功能障礙、進(jìn)行性小頭畸形、四肢痙攣等癥狀；然而其病理機(jī)制至今不明，國際上尚無針對(duì)該病的有效治療方法。

3、人類大腦組織極難獲取，尤其是發(fā)育階段的腦組織標(biāo)本。嚙齒類動(dòng)物模型一直是疾病機(jī)制研究和臨床前藥物評(píng)測(cè)的關(guān)鍵工具，針對(duì)plaa基因缺陷的模型目前僅有突變小鼠被報(bào)道。然而，嚙齒類動(dòng)物通過數(shù)百萬年的進(jìn)化分離，與人類的神經(jīng)系統(tǒng)存在顯著差異；例如，人的大腦皮層出現(xiàn)了非常大的腦室下區(qū)，其中靠近軟腦膜的外側(cè)腦室下區(qū)存在一類特殊的神經(jīng)干細(xì)胞亞型；又如人的大腦皮層包含外側(cè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，而嚙齒類動(dòng)物腦中沒有或僅少量存在。因此，神經(jīng)系統(tǒng)疾病尚不能在人類和嚙齒類動(dòng)物之間準(zhǔn)確轉(zhuǎn)化。

4、目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道在小鼠中觀察到與患者表型相似的大腦胼胝體與小腦體積減小、神經(jīng)功能障礙、后肢癱瘓和神經(jīng)源性肌無力，但并沒有觀察到小頭畸形這一plaa相關(guān)神經(jīng)發(fā)育障礙的典型癥狀，同時(shí)其分子機(jī)理并未闡明。而隨著對(duì)這一基因認(rèn)識(shí)的逐步加深，plaa基因已納入臨床神經(jīng)發(fā)育障礙遺傳學(xué)篩查的芯片篩查范圍，如何判別檢出變異的致病性、并針對(duì)性地研發(fā)治療性藥物是臨床研究面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。傳統(tǒng)的plaa疾病模型并不能滿足這一遺傳性神經(jīng)發(fā)育障礙疾病發(fā)生機(jī)制與治療方法的研究需求，并且目前并沒有能針對(duì)plaa基因進(jìn)行高通量變異致病性、機(jī)制分析及藥物篩選的細(xì)胞模型報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本申請(qǐng)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例提供了一種靶向plaa基因的核酸產(chǎn)品、基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。技術(shù)方案包括：

2、根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例的第一方面，提供了一種靶向plaa基因的核酸產(chǎn)品，所述核酸產(chǎn)品包括第一grna和第二grna；

3、所述第一grna的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；所述第二grna的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

4、根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例的第二方面，提供了一種plaa基因的基因編輯系統(tǒng)，所述基因編輯系統(tǒng)包括上述的核酸產(chǎn)品。

5、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述編輯系統(tǒng)還包括cas9核酸酶和/或cas9?mrna。

6、根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例的第三方面，提供了一種plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

7、采用上述的核酸產(chǎn)品構(gòu)建plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系；所述胚胎干細(xì)胞系中包括plaa?c.62_65del。

8、在其中一個(gè)實(shí)施例中，包括如下步驟：

9、構(gòu)建包含上述的核酸產(chǎn)品的表達(dá)質(zhì)粒；和

10、利用所述表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒感染宿主細(xì)胞感染胚胎干細(xì)胞，構(gòu)建所述plaa基因缺失的胚胎干細(xì)胞系；

11、其中，所述胚胎干細(xì)胞為體外培養(yǎng)且受精14天以內(nèi)的胚胎分離得到的胚胎干細(xì)胞。

12、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述胚胎干細(xì)胞選自chhes-90細(xì)胞、hes-h1細(xì)胞和hes-h9細(xì)胞中的一種或多種。

13、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述慢病毒包裝質(zhì)粒選自pcmv-vsv-g質(zhì)粒。

14、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法還包括對(duì)胚胎干細(xì)胞系的基因型進(jìn)行鑒定的步驟；

15、可選地，所述鑒定的方法包括pcr和sanger測(cè)序中的一種或多種。

16、根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例的第四方面，提供了一種plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系，采用上述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。

17、根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例的第五方面，提供了一種上述的plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系在篩選治療或預(yù)防神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的藥物中的應(yīng)用。

18、與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本申請(qǐng)具有如下有益效果：

19、本申請(qǐng)通過研究篩選得到核苷酸序列如seq?id?no:1~2所示的靶向plaa基因1號(hào)外顯子的sgrna組合，基于上述sgrna組合能夠高效地敲除plaa基因，從而構(gòu)建得到模擬神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)疾病的生物模型，為該疾病的分子機(jī)制探究和藥物篩選提供研究基礎(chǔ)。

20、進(jìn)一步地，本申請(qǐng)的胚胎干細(xì)胞系能夠?yàn)榕咛グl(fā)育初始階段的分子水平的發(fā)病機(jī)制提供線索，同時(shí)基于胚胎干細(xì)胞向終末組織細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，能夠進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)疾病的發(fā)病進(jìn)程進(jìn)行研究。

技術(shù)特征：

1.一種靶向plaa基因的核酸產(chǎn)品，其特征在于，所述核酸產(chǎn)品包括第一grna和第二grna；

2.一種plaa基因的基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述基因編輯系統(tǒng)包括權(quán)利要求1所述的核酸產(chǎn)品。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的plaa基因的基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述編輯系統(tǒng)還包括cas9核酸酶和/或cas9?mrna。

4.一種plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述胚胎干細(xì)胞選自chhes-90細(xì)胞、hes-h1細(xì)胞和hes-h9細(xì)胞中的一種或多種。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述慢病毒包裝質(zhì)粒選自pcmv-vsv-g質(zhì)粒。

8.根據(jù)權(quán)利要求5~7任一項(xiàng)所述的plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法還包括對(duì)胚胎干細(xì)胞系的基因型進(jìn)行鑒定的步驟；

9.一種plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，采用權(quán)利要求4~8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。

10.如權(quán)利要求9所述的plaa基因缺陷的胚胎干細(xì)胞系在篩選治療或預(yù)防神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N靶向PLAA基因的核酸產(chǎn)品、基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。所述核酸產(chǎn)品包括第一gRNA和第二gRNA；所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示?；谏鲜鰏gRNA組合能夠高效地敲除PLAA基因，從而構(gòu)建得到模擬神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)疾病的生物模型，為該疾病的分子機(jī)制研究和藥物篩選提供基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：戴聰伶,曾思聰,周旺,周菂,林戈
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10