本發(fā)明涉及昆蟲細胞培養(yǎng)，具體涉及一種提高草地貪夜蛾(sf9)細胞對全氟和多氟烷基化合物(pfass)毒性耐性的方法。

背景技術：

1、草地貪夜蛾(spodoptera?frugiperda)，是鱗翅目(lepidoptera)夜蛾科灰翅夜蛾屬的一種，其細胞是一種生物學實驗常用昆蟲細胞，簡稱sf9細胞，該細胞通常作為昆蟲平臺用來生產(chǎn)各種蛋白、病毒，或進行基礎研究。

2、pfass類材料廣泛用作各類疏水材料、防粘涂層、消防泡沫等，其可能從各類生產(chǎn)材料、工具、涂層等進入環(huán)境。我們發(fā)現(xiàn)，sf9細胞在培養(yǎng)過程中，外源有機污染物——全氟或多氟烷基化合物(pfass)可對其產(chǎn)生毒害，使細胞出現(xiàn)顆?；?、皺縮、間隙增大、輪廓模糊，細胞核偏移和出現(xiàn)凋亡小體等細胞凋亡特征，最終使細胞徹底失活并死亡。

3、在sf9細胞維持正常生命活動過程中，激素合成至關重要。我們研究發(fā)現(xiàn)，在昆蟲細胞激素合成通路中，膽固醇的轉(zhuǎn)化是一系列激素合成的重要上游環(huán)節(jié)。經(jīng)試驗證實，pfass類有機污染物會嚴重阻礙sf9細胞內(nèi)部的膽固醇轉(zhuǎn)化過程，進而使得細胞內(nèi)環(huán)境膽固醇缺乏，激素合成緩慢或受阻，最終導致sf9細胞進入凋亡狀態(tài)并死亡。

技術實現(xiàn)思路

1、解決的技術問題：為解決技術背景中的問題，本發(fā)明提供一種可有效緩解或預防sf9細胞培養(yǎng)過程中pfass類有機污染物對其生長增殖毒害作用的方法。具體為，在sf9細胞培養(yǎng)階段，向培養(yǎng)基中添加一定濃度膽固醇，通過人工直接供應膽固醇，避免sf9細胞因pfass污染物毒性而產(chǎn)生膽固醇轉(zhuǎn)化障礙，大幅提高sf9細胞對pfass耐性，使sf9細胞能夠正常生殖生長，保證細胞培養(yǎng)質(zhì)量。

2、技術方案：甾醇在制備提高sf9細胞耐受全氟和多氟烷基化合物毒性產(chǎn)品中的應用。

3、上述甾醇為膽固醇或其衍生物。

4、上述全氟和多氟烷基化合物為氯化多氟烷基醚磺酸。

5、一種提高sf9細胞耐受全氟和多氟烷基化合物毒性的保護劑，含有膽固醇或其衍生物。

6、上述膽固醇或其衍生物的含量為0.07～5.4μg?ml-1。

7、一種用于增強sf9細胞對pfass毒性耐性并維持其正常生長增殖的抗pfass毒性sf9細胞培養(yǎng)基，按照體積濃度計，由以下成分組成：有效成分濃度：膽固醇0.07～5.4μgml-1；培養(yǎng)基體：sf9昆蟲細胞無血清無動物源培養(yǎng)基ⅱ(不含膽固醇)；其中，有效成分為膽固醇(cholesterol)，培養(yǎng)基體為“sf9昆蟲細胞無血清無動物源無膽固醇培養(yǎng)基ⅱ(不含膽固醇)”(以下簡稱“sf9培養(yǎng)基”)。

8、細胞保護培養(yǎng)基具體配制與細胞培養(yǎng)步驟如下：

9、(1)培養(yǎng)基制備。取膽固醇(又名：膽甾醇，英文名；cholesterol，化學式：c27h46o，cas：57-88-5)母液(4000mg?l-1)，根據(jù)所需培養(yǎng)基體積與膽固醇濃度，轉(zhuǎn)移確定量膽固醇母液至sf9培養(yǎng)基并稀釋至目標濃度(0.2、0.6、1.7、5、15μg?ml-1)。根據(jù)所需培養(yǎng)基體積，混合均勻，分裝備用。

10、(2)鋪板。首先用無膽固醇不含血清培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的9×107sf9細胞于50ml離心管中，用培基補充至45ml，用巴氏吸管混勻。再向六孔板每孔加入1000μl無膽固醇培基，后每孔加入1000μl培基，鋪板54塊，混勻。27℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

11、(3)換液。每孔棄去500μl培基，吸取600μl含0、3、9、30、90、270μg/ml?f-53b，及600μl含0、0.2、0.6、1.7、5、15μg/ml的膽固醇的培養(yǎng)基于六孔板中，此時對應的培養(yǎng)基濃度分別為0、1、3、10、30、90μg/ml?f-53b，及0、0.07、0.2、0.6、1.8、5.4μg/ml膽固醇。27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72h。共36×3個處理，3重復，324個樣本。

12、(4)0、24、48、72h拍照。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

13、(5)24、48、72h上清液取樣。吸取上清液于1.5ml?ep管中，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去除沉淀，1000μl、500μl分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

14、(6)24、48、72h細胞取樣。在去除培養(yǎng)液的六孔板中每孔加入200ml?trizol，將消化液迅速轉(zhuǎn)移到1.5ml?ep管中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

15、一種抗pfass毒性sf9細胞培養(yǎng)基的應用：本培養(yǎng)基適用于預防或緩解sf9細胞因pfass毒性而產(chǎn)生的細胞凋亡現(xiàn)象，使sf9細胞在pfass毒性存在下維持正常增殖生長。

16、有益效果：本培養(yǎng)基使用后，可有效預防或緩解sf9細胞因pfass毒性而導致的胞質(zhì)顆?；櫩s、間隙增大、輪廓模糊，細胞核偏移和出現(xiàn)凋亡小體等細胞凋亡特征，大幅減少細胞死亡數(shù)量，使細胞活力恢復至正常水平。

技術特征：

1.甾醇在制備提高sf9細胞耐受全氟和多氟烷基化合物毒性產(chǎn)品中的應用。

2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述甾醇為膽固醇或其衍生物。

3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述全氟和多氟烷基化合物為氯化多氟烷基醚磺酸。

4.一種提高sf9細胞耐受全氟和多氟烷基化合物毒性的保護劑，其特征在于，含有膽固醇或其衍生物。

5.根據(jù)權利要求3所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述膽固醇或其衍生物的含量為0.07～5.4?μg?ml-1。

技術總結
一種提高昆蟲細胞耐毒性的方法，在草地貪夜蛾（Sf9）細胞培養(yǎng)過程中，可能受到外源有毒污染物——全氟或多氟烷基化合物（PFASs）的毒害，該物質(zhì)會使Sf9細胞出現(xiàn)胞質(zhì)顆?；?、皺縮、間隙增大、輪廓模糊，細胞核偏移和出現(xiàn)凋亡小體等細胞凋亡特征，使細胞失活并死亡。為解決PFASs污染對Sf9細胞的毒害問題，本發(fā)明提供一種可有效緩解或預防該毒害的方法，該方法基于我們發(fā)明的濃度為0.07～5.4?μg?mL<supgt;?1</supgt;的膽固醇保護劑。具體實施方法為，在Sf9細胞培養(yǎng)前，預先向培養(yǎng)基中加入上述濃度的膽固醇，使細胞在生長增殖過程中避免因PFASs的干擾產(chǎn)生膽固醇轉(zhuǎn)化障礙，維持Sf9細胞的正常生命活動。

技術研發(fā)人員：梁芳,吳龍華,王孜楠,柯欣,李柱,畢德,駱永明
受保護的技術使用者：中國科學院南京土壤研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/23