本發(fā)明屬于基因工程與蛋白質(zhì)改造，具體涉及一種脂肪酶突變體及其在合成功能性脂質(zhì)opl中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、脂肪酶是一類可以水解甘油三酯生成不同鏈長的游離脂肪酸與甘油的水解酶。從催化特性看，脂肪酶反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少且反應(yīng)不需輔酶，同時具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)性。同時，脂肪酶還具有催化酯水解、酯合成、轉(zhuǎn)酯化、氨解、醇解、藥物合成等作用。

2、脂肪酶的主要來源有植物、動物和微生物。微生物具有種類多、繁殖快、易變異的特點，其分泌的脂肪酶種類繁多，底物廣譜性大，可適應(yīng)不同的ph值與溫度范圍，有些極端環(huán)境獲取的微生物菌株其酶學(xué)特性更加突出。目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)脂肪酶的微生物分布非常廣泛，已分離鑒定的達(dá)60余個屬，其中酵母菌有10個屬、其它真菌有23個屬、放線菌有4個屬、細(xì)菌有28個屬。高產(chǎn)脂肪酶的真菌菌株多來源于根酶(rhizopus)、曲霉(aspergillus)、青霉(penicillium)、毛霉(mucor)、地霉(geotrichum)等等。

3、母乳是嬰兒最佳的食物來源，可以滿足嬰幼兒對各種營養(yǎng)素的需求，大大減少其患腹瀉、傳染病、過敏性疾病和營養(yǎng)不良的機(jī)會，降低嬰幼兒死亡率，并可降低成年期的慢性疾病風(fēng)險。母乳中含有3％-5％的脂肪，其中包括98％的甘油三酯、1％磷脂、0.5％膽固醇和膽固醇脂以及其他的脂肪伴隨物。隨著科學(xué)家對母乳脂質(zhì)的研究進(jìn)展，業(yè)界內(nèi)提出了越來越多與母乳脂肪相似的人乳替代脂結(jié)構(gòu)，例如目前大家比較熟悉的opo、opl、upu等。

4、opo是嬰幼兒配方奶粉中大家耳熟能詳?shù)囊粋€營養(yǎng)成分。opo全稱1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol)，是人乳中含量最高的甘油三酯之一。opo作為一種人乳替代脂，模擬了母乳脂肪中的一種甘油三酯，但母乳脂肪中具有類似結(jié)構(gòu)的甘油三酯有很多種，僅添加一種opo很難使得整體脂肪酸組成及其位置分布與母乳脂肪相似，因此并不是全價人乳替代脂。除此之外，針對各國母乳成分的研究成果顯示，各國母乳成分之間的差異性較大，比如歐美母乳中opo含量最多，而中國母乳含量最高的并非opo，而是opl，即1-油酸-2-棕櫚酸-3亞油酸甘油三酯(1-palmitoyl-2-oleoyl-3-linoleoylglycerol)。

5、當(dāng)前主要采用酶法合成opo、opl，其優(yōu)點是反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好，產(chǎn)品安全，并且脂肪酶很容易從產(chǎn)物中分離出來。酶法合成opo采用的酸解法，主要是采用sn-2位富含棕櫚酸的油脂和油酸為底物，在sn-1，3位專一性脂肪酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，此方法可制備出純度高且副產(chǎn)物少的產(chǎn)品。而酶法合成opl，則需要采用sn-2位富含棕櫚酸的油脂和亞油酸為底物進(jìn)行酶法合成。目前開發(fā)適用于opl合成的脂肪酶是本領(lǐng)域的研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種比活力提高的脂肪酶突變體及其在合成功能性脂質(zhì)opl中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了一種脂肪酶突變體，其包含與seq?id?no:2具有至少90％同一性的氨基酸序列，且與seq?id?no:2相比在選自下組中的至少一個位置上包含氨基酸的取代：287、306、335、359。

3、在本發(fā)明的一些實施例中，所述突變體的氨基酸序列與seq?id?no:2相比具有至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或至少99％的同一性。

4、在一些更具體的實施例中，所述突變體的氨基酸序列與seq?id?no:2相比具有至少99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，或至少99.9％的同一性。

5、在本發(fā)明的一些實施例中，所述突變體包含下組中至少一個氨基酸的取代：e287s，v306t，e335a，d359l。

6、在本發(fā)明的一些實施例中，所述突變體包含下組中至少一個氨基酸的取代或取代組合：

7、e287s；

8、v306t；

9、e335a；

10、d359l；

11、e287s/v306t；

12、e287s/e335a；

13、e287s/d359l；

14、v306t/e335a；

15、v306t/d359l；

16、e335a/d359l；

17、e287s/v306t/e335a；

18、e287s/v306t/d359l；

19、e287s/e335a/d359l；

20、v306t/e335a/d359l；

21、e287s/v306t/e335a/d359l。

22、在本發(fā)明的一些實施例中，所述突變體的氨基酸序列為seq?id?no：3或seq?idno：4或seq?id?no：5或seq?id?no：6或seq?id?no：7或seq?id?no：8或seq?id?no：9。

23、本發(fā)明還涉及編碼上述脂肪酶突變體的dna分子。

24、本發(fā)明還涉及包含上述dna分子的重組表達(dá)載體。

25、本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，包含上述重組表達(dá)載體。

26、將上述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，重組表達(dá)的脂肪酶突變體的比活力得到顯著提升。

27、所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母(pichia?pastoris)。

28、所述宿主細(xì)胞為黑曲霉(aspergillus?niger)。

29、所述宿主細(xì)胞為里氏木霉(trichoderma?reesei)。

30、本發(fā)明還涉及上述脂肪酶突變體在功能性脂質(zhì)opl合成中的應(yīng)用。

31、本發(fā)明以野生型脂肪酶rcl為基礎(chǔ)，提供了分別包含e287s、v306t、e335a、d359l單點突變及其組合的突變體，能顯著提高脂肪酶的比活力。所述脂肪酶突變體可廣泛應(yīng)用于合成功能性脂質(zhì)opl，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)特征：

1.一種脂肪酶突變體，其特征在于，所述突變體包含與seq?id?no:2具有至少90%同一性的氨基酸序列，且與seq?id?no:2相比在選自下組中的至少一個位置上包含氨基酸的取代：287、306、335、359。

2.如權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列與seq?id?no:2相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。

3.如權(quán)利要求2所述的突變體，其特征在于，所述突變體包含下組中至少一個氨基酸的取代：e287s，v306t，e335a，d359l。

4.如權(quán)利要求3所述的突變體，其特征在于，所述突變體包含下組中至少一個氨基酸的取代或組合：

5.如權(quán)利要求4所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列為seq?id?no：3或seq?id?no：4或seq?id?no：5或seq?id?no：6或seq?id?no：7或seq?id?no：8或seq?id?no：9。

6.編碼權(quán)利要求1-5任一所述脂肪酶突變體的dna分子。

7.包含權(quán)利要求6所述dna分子的重組表達(dá)載體。

8.包含權(quán)利要求7所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母（pichia?pastoris）或黑曲霉（aspergillus?niger）或里氏木霉（trichoderma?reesei）。

10.權(quán)利要求1-5任一所述脂肪酶突變體在功能性脂質(zhì)opl合成中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程與蛋白質(zhì)改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪酶突變體及其在合成功能性脂質(zhì)OPL中的應(yīng)用。以野生型脂肪酶RCL為基礎(chǔ)，提供了分別包含E287S、V306T、E335A、D359L單點突變及其組合的突變體，能顯著提高脂肪酶的比活力。所述脂肪酶突變體可廣泛應(yīng)用于合成功能性脂質(zhì)OPL，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)研發(fā)人員：徐曉東,陸娜,劉文瑤,葛菁華,曹體爽,李瑞,李玉強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/11