本發(fā)明實(shí)施例涉及細(xì)胞工程，具體涉及一種nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、nf2型神經(jīng)纖維瘤病(nf2-related?schwannomatosis,nf2)是一種常染色體顯性遺傳病，因染色體22q12上的nf2基因突變引起抑癌蛋白merlin失活，造成多系統(tǒng)多發(fā)病變。nf2的臨床表現(xiàn)包括雙側(cè)前庭神經(jīng)鞘瘤(發(fā)病率90％-95％)、多發(fā)腦膜瘤(發(fā)病率45％-58％)、白內(nèi)障(發(fā)病率60％-81％)和皮膚腫瘤(發(fā)病率59％-68％)等，其余相對(duì)少見(jiàn)的臨床表現(xiàn)有脊髓室管膜瘤、周?chē)窠?jīng)病變等。由于上述病變?cè)趎f2的疾病進(jìn)程中持續(xù)進(jìn)展，難以通過(guò)單次手術(shù)治療實(shí)現(xiàn)根治，因此亟需探索全身性治療方案以減輕患者腫瘤負(fù)擔(dān)。

2、為進(jìn)一步探索nf2的治療方案，需要準(zhǔn)確且高效的nf2臨床前模型作為揭示發(fā)病機(jī)制、疾病進(jìn)展、腫瘤異質(zhì)性和治療靶點(diǎn)等的研究工具。臨床前模型主要包括永生化細(xì)胞系、移植瘤動(dòng)物模型和基因編輯動(dòng)物模型等，可從多個(gè)角度驗(yàn)證治療方案的療效、毒性和不良反應(yīng)。細(xì)胞系是其中常用的、相對(duì)價(jià)廉且易于操作的模型。直接提取自患者的原代細(xì)胞大多在數(shù)次傳代后衰老調(diào)亡，無(wú)法滿(mǎn)足研究需求，而通過(guò)基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因如sv40t(sv40大t抗原)、sv40(人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)等導(dǎo)入原代細(xì)胞內(nèi)所建立的永生化細(xì)胞系具有無(wú)限增殖的能力，可持續(xù)提供同質(zhì)性良好的研究模型。

3、目前報(bào)道的直接來(lái)源于nf2病人的細(xì)胞系僅有一株nf2前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞系hei193，亟需更多的永生化細(xì)胞系以充分反映nf2的疾病表型，探索nf2的潛在治療靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該細(xì)胞系可連續(xù)增殖傳代，且細(xì)胞間無(wú)差異，為nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)領(lǐng)域研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第一方面，本發(fā)明提供一種nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系nf2-vs-llab-1，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.45803，保藏時(shí)間為2024年1月10日。

4、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第二方面，本發(fā)明提供一種如上所述的nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，向nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性永生化基因sv40和hpv-16e6/e7，篩選陽(yáng)性克隆并傳代培養(yǎng)以獲得nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系。

5、進(jìn)一步地，所述方法包括：將nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞接種于六孔板中，使用慢病毒載體將外源性永生化基因sv40和hpv-16e6/e7導(dǎo)入細(xì)胞中，在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；連續(xù)使用一周1μg/ml的嘌呤霉素篩選感染成功的細(xì)胞，觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后進(jìn)行傳代，細(xì)胞持續(xù)增殖傳代至超過(guò)20代則視為永生化細(xì)胞系建立成功。

6、進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基為：含有10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基。

7、進(jìn)一步地，所述nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

8、1)向新鮮nf2相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤標(biāo)本中加入消化酶，置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中消化2-4小時(shí)；

9、2)過(guò)濾除去未被消化的碎塊，收集細(xì)胞濾液，以1000rpm離心5分鐘，棄上清；

10、3)向沉淀加入紅細(xì)胞裂解液靜置2分鐘后加入10ml?pbs重懸，1000rpm離心5分鐘，棄上清；

11、4)向沉淀加入10ml?pbs重懸，1000rpm離心5分鐘，棄上清；

12、5)向沉淀加入含有10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

13、6)每隔48-72小時(shí)換液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下觀察，挑選前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞。

14、進(jìn)一步地，所述消化酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或膠原酶。

15、進(jìn)一步地，所述過(guò)濾采用粒徑為70μm或40μm的細(xì)胞濾網(wǎng)。

16、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第三方面，本發(fā)明提供如上所述的nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的用途，所述用途選自如下任一項(xiàng)：

17、a.制備nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞或動(dòng)物模型；

18、b.制備用于治療nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤的藥物；

19、c.篩選nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤的治療靶點(diǎn)。

20、本發(fā)明實(shí)施例具有如下優(yōu)點(diǎn)：

21、本發(fā)明通過(guò)慢病毒載體將外源性永生化基因sv40和hpv-16e6/e7導(dǎo)入nf2相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞中，成功構(gòu)建了一株可持續(xù)增值傳代的永生化nf2相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞系，并證實(shí)了該構(gòu)建方法的有效性。本發(fā)明為nf2相關(guān)領(lǐng)域研究提供了同質(zhì)性良好、操作簡(jiǎn)便的臨床前研究模型。

技術(shù)特征：

1.一種nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系nf2-vs-llab-1，其特征在于，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.45803，保藏時(shí)間為2024年1月10日。

2.一種如權(quán)利要求1所述的nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，向nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性永生化基因sv40和hpv-16e6/e7，篩選陽(yáng)性克隆并傳代培養(yǎng)以獲得nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為：含有10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述消化酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或膠原酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述過(guò)濾采用粒徑為70μm或40μm的細(xì)胞濾網(wǎng)。

8.如權(quán)利要求1所述的nf2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的用途，其特征在于，所述用途選自如下任一項(xiàng)：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種NF2型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。該永生化細(xì)胞系保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC?No.45803，保藏時(shí)間為2024年1月10日。本發(fā)明通過(guò)慢病毒載體將外源性永生化基因SV40和HPV?16E6/E7導(dǎo)入NF2相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞中，成功構(gòu)建了一株可持續(xù)增殖傳代的永生化NF2相關(guān)前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞系，并證實(shí)了該構(gòu)建方法的有效性。本發(fā)明為NF2相關(guān)領(lǐng)域研究提供了同質(zhì)性良好、操作簡(jiǎn)便的的臨床前研究模型。

技術(shù)研發(fā)人員：汪穎,嚴(yán)敏君,王博,劉丕楠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京市神經(jīng)外科研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/28