本發(fā)明實(shí)施例涉及細(xì)胞工程，具體涉及一種smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、smarcb1型神經(jīng)纖維瘤病(smarcb1-related?schwannomatosis，smarcb1-swn)是一種常染色體顯性遺傳病，因染色體22q上的smarcb1基因突變造成多系統(tǒng)多發(fā)病變，其臨床表現(xiàn)包括中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)神經(jīng)鞘瘤等。由于上述病變在smarcb1-swn的疾病進(jìn)程中持續(xù)進(jìn)展，難以通過單次手術(shù)治療實(shí)現(xiàn)根治，因此亟需探索全身性治療方案以減輕患者腫瘤負(fù)擔(dān)。

2、為進(jìn)一步探索smarcb1-swn的治療方案，需要準(zhǔn)確且高效的smarcb1-swn臨床前模型作為揭示發(fā)病機(jī)制、疾病進(jìn)展、腫瘤異質(zhì)性和治療靶點(diǎn)等的研究工具。臨床前模型主要包括永生化細(xì)胞系、移植瘤動物模型和基因編輯動物模型等，可從多個角度驗(yàn)證治療方案的療效、毒性和不良反應(yīng)。細(xì)胞系是其中常用的、相對價廉且易于操作的模型。直接提取自患者的原代細(xì)胞大多在數(shù)次傳代后衰老調(diào)亡，無法滿足研究需求，因此，有必要構(gòu)建出具有無限增殖的能力的永生化細(xì)胞系，以持續(xù)提供同質(zhì)性良好的研究模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該細(xì)胞系可連續(xù)增殖傳代，且細(xì)胞間無差異，為smarcb1型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)領(lǐng)域研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第一方面，本發(fā)明提供一種smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系nf3-sch-llab-1，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.45802，保藏時間為2024年1月10日。

4、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第二方面，本發(fā)明提供一種如上所述的smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，向smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性永生化基因htert和sv40t，篩選陽性克隆并傳代培養(yǎng)以獲得smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系。

5、進(jìn)一步地，所述方法包括：

6、將smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接種于六孔板中，使用慢病毒載體將外源性永生化基因htert和sv40t導(dǎo)入細(xì)胞中，在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

7、連續(xù)使用一周1μg/ml的嘌呤霉素篩選感染成功的細(xì)胞，觀察細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代，細(xì)胞持續(xù)增殖傳代至超過20代則視為永生化細(xì)胞系建立成功。

8、進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基為：含有10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基。

9、進(jìn)一步地，所述smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

10、1)向新鮮smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤標(biāo)本中加入消化酶，置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中消化2-4小時；

11、2)過濾除去未被消化的碎塊，收集細(xì)胞濾液，以1000rpm離心5分鐘，棄上清；

12、3)向沉淀加入紅細(xì)胞裂解液靜置2分鐘后加入10ml?pbs重懸，1000rpm離心5分鐘，棄上清；

13、4)向沉淀加入10ml?pbs重懸，1000rpm離心5分鐘，棄上清；

14、5)向沉淀加入含有10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

15、6)每隔48-72小時換液，對細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下觀察，挑選神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞。

16、進(jìn)一步地，所述消化酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或膠原酶。

17、進(jìn)一步地，所述過濾采用粒徑為70μm或40μm的細(xì)胞濾網(wǎng)。

18、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第三方面，本發(fā)明提供如上所述的smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的用途，所述用途選自如下任一項(xiàng)：

19、a.制備smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞或動物模型；

20、b.制備用于治療smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤的藥物；

21、c.篩選smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤的治療靶點(diǎn)。

22、本發(fā)明實(shí)施例具有如下優(yōu)點(diǎn)：

23、本發(fā)明通過慢病毒載體將外源性永生化基因htert(人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)和sv40t(sv40大t抗原)導(dǎo)入smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞中，成功構(gòu)建了一株可持續(xù)增殖傳代的永生化smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞系，并證實(shí)了該構(gòu)建方法的有效性。本發(fā)明為smarcb1-swn相關(guān)領(lǐng)域研究提供了同質(zhì)性良好、操作簡便的臨床前研究模型。

技術(shù)特征：

1.一種smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系nf3-sch-llab-1，其特征在于，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.45802，保藏時間為2024年1月10日。

2.一種如權(quán)利要求1所述的smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，向smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性永生化基因htert和sv40t，篩選陽性克隆并傳代培養(yǎng)以獲得smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為：含有10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述消化酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或膠原酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述過濾采用粒徑為70μm或40μm的細(xì)胞濾網(wǎng)。

8.如權(quán)利要求1所述的smarcb1-swn相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系的用途，其特征在于，所述用途選自如下任一項(xiàng)：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明實(shí)施例公開了一種SMARCB1?SWN相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。該永生化細(xì)胞系NF3?Sch?Llab?1保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.45802，保藏時間為2024年1月10日。本發(fā)明通過慢病毒載體將外源性永生化基因hTERT和SV40T導(dǎo)入SMARCB1型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞中，成功構(gòu)建了一株可持續(xù)增殖傳代的SMARCB1型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)神經(jīng)鞘瘤永生化細(xì)胞系，并證實(shí)了該構(gòu)建方法的有效性。本發(fā)明為SMARCB1型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)領(lǐng)域研究提供了同質(zhì)性良好、操作簡便的的臨床前研究模型。

技術(shù)研發(fā)人員：王博,嚴(yán)敏君,汪穎,劉丕楠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/14