本發(fā)明屬于卵母細(xì)胞超低溫冷凍保存，尤其涉及提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的sirna及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、卵母細(xì)胞冷凍保存是生育力保存的基本手段，在輔助生殖技術(shù)中發(fā)揮重要作用。盡管卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但冷凍卵母細(xì)胞解凍后發(fā)育能力下降，較低的冷凍效率已成為制約冷凍卵母細(xì)胞應(yīng)用的主要限制因素。線粒體功能是卵母細(xì)胞正常發(fā)育的保障，而線粒體對(duì)冷凍解凍過(guò)程中的溫度、滲透壓變化極為敏感，研究指出冷凍卵母細(xì)胞中線粒體形態(tài)及空間分布異常，冷凍可引發(fā)線粒體功能異常。鑒于線粒體在卵母細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用，維持線粒體功能可提高冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力。

2、線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(mtupr)是線粒體應(yīng)對(duì)外界環(huán)境刺激的主要應(yīng)答機(jī)制，線粒體分子伴侶熱休克蛋白60(hsp60)是mtupr發(fā)生的生物標(biāo)記物，在線粒體功能維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。激活轉(zhuǎn)錄因子5(atf5)是哺乳動(dòng)物mtupr發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子，研究表明atf5是哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體應(yīng)激后細(xì)胞器恢復(fù)所必需的。目前，atf5對(duì)冷凍卵母細(xì)胞線粒體功能及發(fā)育能力的影響尚不知曉。

3、rna干擾(rnai)是調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的有效方法，可高效、特異性抑制靶mrna表達(dá)。外源性小干擾rna(sirna)是主要的rnai分子，可誘導(dǎo)沉默復(fù)合物形成，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。rnai已被證明是一種適應(yīng)性強(qiáng)、功能強(qiáng)大的治療策略，現(xiàn)已經(jīng)批準(zhǔn)了多種sirna藥物，數(shù)種基于rnai的治療方法也在推進(jìn)臨床試驗(yàn)。然而，靶向atf5的sirna用于提高冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的sirna及其應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了一種抑制atf5基因表達(dá)的sirna分子，并評(píng)估其對(duì)冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，以期在冷凍應(yīng)激條件下維持線粒體功能，提高冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的sirna分子，所述sirna分子的核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。

3、本發(fā)明還提供了所述sirna分子在制備提高冷凍保存卵母細(xì)胞發(fā)育能力制劑中的應(yīng)用。

4、優(yōu)選的，所述冷凍保存為-196℃超低溫冷凍保存。

5、優(yōu)選的，所述sirna分子通過(guò)抑制atf5基因的表達(dá)，進(jìn)而維持線粒體功能，提高冷凍保存卵母細(xì)胞發(fā)育能力。

6、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述atf5基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7、本發(fā)明還提供了一種提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的制劑，包括所述sirna分子。

8、優(yōu)選的，所述制劑還包括藥學(xué)上可接受的輔料。

9、優(yōu)選的，所述制劑為注射劑。

10、本發(fā)明還提供了一種提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物包括所述sirna分子。

11、本發(fā)明還提供了一種提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的方法，包括以下步驟：在獲取卵母細(xì)胞后，注射所述sirna分子，然后冷凍保存。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

13、本發(fā)明以小鼠卵母細(xì)胞為模型，通過(guò)rna干擾的方式，沉默卵母細(xì)胞atf5基因，從而在冷凍應(yīng)激環(huán)境下維持線粒體功能，增強(qiáng)卵母細(xì)胞冷凍耐受性，提高冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力。提供了靶向抑制atf5基因表達(dá)的sirna，核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。該sirna在卵母細(xì)胞冷凍中的應(yīng)用，顯微注射sirna至卵母細(xì)胞胞質(zhì)，sirna可特異性地沉默靶基因mrna表達(dá)，結(jié)果顯示注射sirna后卵母細(xì)胞atf5基因表達(dá)量顯著降低，冷凍應(yīng)激下線粒體功能得以維持，冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力提高。

技術(shù)特征：

1.提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的sirna分子，其特征在于，所述sirna分子的核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。

2.如權(quán)利要求1所述sirna分子在制備提高冷凍保存卵母細(xì)胞發(fā)育能力制劑中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述冷凍保存為-196℃超低溫冷凍保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述sirna分子通過(guò)抑制atf5基因的表達(dá)，進(jìn)而維持線粒體功能，提高冷凍保存卵母細(xì)胞發(fā)育能力。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述atf5基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

6.一種提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的制劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述sirna分子。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制劑，其特征在于，所述制劑還包括藥學(xué)上可接受的輔料。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述制劑，其特征在于，所述制劑為注射劑。

9.一種提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的核酸構(gòu)建物，其特征在于，所述核酸構(gòu)建物包括權(quán)利要求1所述sirna分子。

10.一種提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的方法，其特征在于，包括以下步驟：在獲取卵母細(xì)胞后，注射權(quán)利要求1所述sirna分子，然后冷凍保存。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的siRNA及其應(yīng)用，屬于卵母細(xì)胞超低溫冷凍保存技術(shù)領(lǐng)域，提供的提高凍存卵母細(xì)胞發(fā)育能力的siRNA分子，所述siRNA分子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示，提供的所述siRNA分子在制備提高冷凍保存卵母細(xì)胞發(fā)育能力制劑中的應(yīng)用。提供了靶向抑制Atf5基因表達(dá)的siRNA，顯微注射至卵母細(xì)胞胞質(zhì)，可特異性地沉默靶基因mRNA表達(dá)，Atf5基因表達(dá)量顯著降低，冷凍應(yīng)激下線粒體功能得以維持，冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力提高。

技術(shù)研發(fā)人員：傅祥偉,李俊,周桂珍,劉愛(ài)菊,白佳琛,羅渝雯,依再提古麗·熱依木江,朱一笑,侯云鵬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/28