本發(fā)明涉及藥物敏感性檢測(cè)，尤其涉及一種胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、胰腺癌是全球第五大常見(jiàn)癌癥和中國(guó)第二大致命惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。早期胰腺癌患者無(wú)明顯癥狀，多數(shù)胰腺癌患者確診時(shí)已發(fā)展至中晚期。胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性較差，因此其化療效果差，導(dǎo)致五年生存率低。類(lèi)器官培養(yǎng)是在三維環(huán)境中培養(yǎng)出的特定組織器官包含的多種細(xì)胞類(lèi)群，組成與體內(nèi)器官相似，其培養(yǎng)體系與體內(nèi)微環(huán)境更為接。近年來(lái)隨著類(lèi)器官技術(shù)的快速發(fā)展，類(lèi)器官模型在基礎(chǔ)研究、精準(zhǔn)醫(yī)療、藥物篩選和開(kāi)發(fā)、基因治療等領(lǐng)域廣泛運(yùn)用。然而類(lèi)器官的操作時(shí)間長(zhǎng)，培養(yǎng)成功率低很大程度減少了在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用。

2、申請(qǐng)?zhí)枮閏n202311023031.4的專(zhuān)利中公開(kāi)了一種體液腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)方法及藥敏檢測(cè)方法。申請(qǐng)?zhí)枮閏n202111189130.0的專(zhuān)利中公開(kāi)了一種基于染色法的腫瘤類(lèi)器官藥物敏感性檢測(cè)方法，該專(zhuān)利將腫瘤類(lèi)器官與抗腫瘤藥物混合后在藥敏培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，再采用細(xì)胞熒光染色劑對(duì)腫瘤類(lèi)器官進(jìn)行染色，之后將染色類(lèi)器官處理為單細(xì)胞后進(jìn)行活性檢測(cè)以及藥敏分析評(píng)估。本發(fā)明的腫瘤類(lèi)器官藥物敏感性檢測(cè)方法是基于細(xì)胞染色，使用腫瘤患者源的類(lèi)器官，直接計(jì)算活死細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行活力分析，從而判斷樣本對(duì)藥物的敏感性。

3、但都存在缺乏針對(duì)胰腺類(lèi)器官的專(zhuān)一性，密度的不均一性容易降低類(lèi)器官活性檢測(cè)的成功率。根本原因是類(lèi)器官的均一性差，培養(yǎng)難度高，藥敏檢測(cè)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致類(lèi)器官數(shù)量不足而引起結(jié)果差異大，因此類(lèi)器官的數(shù)量，大小對(duì)類(lèi)器官藥敏檢測(cè)過(guò)程中至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

3、提供一種胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，使用胰腺癌組織類(lèi)器官消化液培養(yǎng)胰腺癌類(lèi)器官，包括如下步驟：

4、s1、獲取胰腺癌類(lèi)器官組織樣本，將胰腺癌組織類(lèi)器官樣本用預(yù)冷的pbs緩沖液反復(fù)清洗，剪碎成碎片，加入胰腺癌組織類(lèi)器官消化液；

5、s2、加入預(yù)冷的pbs緩沖液，終止原代消化，反復(fù)吹打直至組織碎片消失，取出部分消化后的溶液，當(dāng)在顯微鏡下觀察為均勻的細(xì)胞團(tuán)時(shí)，通過(guò)低溫低速離心，重懸細(xì)胞團(tuán)，通過(guò)顯微鏡對(duì)細(xì)胞團(tuán)數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)需要接種的孔數(shù)，將相應(yīng)的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至離心管離心；

6、s3、將酶解后的細(xì)胞團(tuán)加入基底膠重懸，接種至tc細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，當(dāng)基底膠凝固后，加入advanced?dmem/f-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，期間定期觀察并換液；

7、s4、胰腺癌類(lèi)組織類(lèi)器官培養(yǎng)5-7天后，向所述tc細(xì)胞培養(yǎng)板中加入預(yù)冷的pbs緩沖液，將基底膠轉(zhuǎn)移至離心管，反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至冰箱內(nèi)靜置，離心去除上清，獲得胰腺癌組織類(lèi)器官；

8、s5、將所述步驟s4獲得的胰腺癌組織類(lèi)器官進(jìn)行酶解消化，并獲得胰腺癌組織類(lèi)器官碎片；

9、s6、將步驟s5獲得的胰腺癌組織類(lèi)器官碎片使用基底膠重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為200-300個(gè)/25μl，接種入24孔板，待基底膠凝固后加入胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基；

10、s7、將步驟s6獲得的胰腺癌組織類(lèi)器官碎片使用基底膠重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為30-50個(gè)/5μl，接種入96孔板，待基底膠凝固后加入胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基；

11、s8、將步驟s7中胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基完全去除，添加含有不同藥物濃度的胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基，選擇全孔視野在加藥后連續(xù)拍照，記錄類(lèi)器官的形態(tài)，大??；

12、s9、在藥物作用至第72h，重新添加含有不同藥物濃度的胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基；在藥物作用類(lèi)器官120h后，棄去培養(yǎng)基，添加atp檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)類(lèi)器官活性。

13、進(jìn)一步地，所述s1中，消化的條件為：37℃，震蕩消化10-20min。

14、進(jìn)一步地，所述s3中，tc細(xì)胞培養(yǎng)板選自包括6孔、12孔、24孔、48孔中的一個(gè)。

15、進(jìn)一步地，所述s4中，冰箱設(shè)置的溫度為4℃。

16、進(jìn)一步地，所述s5中，使用tryple?express對(duì)獲得的類(lèi)器官碎片進(jìn)行酶解消化。

17、進(jìn)一步地，所述酶解消化的操作為：加1-2ml的tryple?express，消化2-3min，邊吹打邊消化，加入6-8ml預(yù)冷的pbs緩沖液，300g離心5min，終止酶解消化。

18、本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

19、本發(fā)明的檢測(cè)方法，針對(duì)胰腺類(lèi)器官，通過(guò)胰腺癌組織類(lèi)器官消化液結(jié)合培養(yǎng)基培養(yǎng)類(lèi)器官的方法，得到均一性更好的胰腺組織類(lèi)器官，用于藥敏檢測(cè)；并根據(jù)藥物作用機(jī)制和類(lèi)器官特性，調(diào)整藥物處理時(shí)間和觀察時(shí)間，以獲得最佳的藥效評(píng)估，克服了現(xiàn)有技術(shù)中類(lèi)器官藥敏判讀誤差大的問(wèn)題。

技術(shù)特征：

1.一種胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，使用胰腺癌組織類(lèi)器官消化液培養(yǎng)胰腺癌類(lèi)器官，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，其特征在于，所述s1中，消化的條件為：37℃，震蕩消化10-20min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，其特征在于，所述s3中，tc細(xì)胞培養(yǎng)板選自包括6孔、12孔、24孔、48孔中的一個(gè)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，其特征在于，所述s4中，冰箱設(shè)置的溫度為4℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，其特征在于，所述s5中，使用tryple?express對(duì)獲得的類(lèi)器官碎片進(jìn)行酶解消化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，其特征在于，所述酶解消化的操作為：加1-2ml的tryple?express，消化2-3min，邊吹打邊消化，加入6-8ml預(yù)冷的pbs緩沖液，300g離心5min，終止酶解消化。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種胰腺癌組織類(lèi)器官藥敏的檢測(cè)方法，將胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基完全去除，添加含有不同藥物濃度的胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基，選擇全孔視野在加藥后連續(xù)拍照，記錄類(lèi)器官的形態(tài)，大小；在藥物作用至第72h，重新添加含有不同藥物濃度的胰腺癌組織類(lèi)器官的培養(yǎng)基；在藥物作用類(lèi)器官120h后，棄去培養(yǎng)基，添加ATP檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)類(lèi)器官活性。本發(fā)明針對(duì)胰腺類(lèi)器官，通過(guò)胰腺癌組織類(lèi)器官消化液結(jié)合培養(yǎng)基培養(yǎng)類(lèi)器官的方法，得到均一性更好的胰腺組織類(lèi)器官，用于藥敏檢測(cè)；并根據(jù)藥物作用機(jī)制和類(lèi)器官特性，調(diào)整藥物處理時(shí)間和觀察時(shí)間，以獲得最佳的藥效評(píng)估，克服了現(xiàn)有技術(shù)中類(lèi)器官藥敏判讀誤差大的問(wèn)題。

技術(shù)研發(fā)人員：楊德君,王偉軍,李長(zhǎng)杰,方國(guó)慶
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30