本發(fā)明屬于醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域，具體涉及一種表皮痣相關(guān)的基因檢測(cè)panel及其應(yīng)用，更具體地涉及一種通過靶向高通量深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)表皮痣及相關(guān)疾病致病基因、突變位點(diǎn)的基因檢測(cè)panel及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、表皮痣為一種常見的表皮及附屬器增生性錯(cuò)構(gòu)瘤樣病變，患病率約為1：1000，典型病例出生時(shí)即出現(xiàn)皮損，兒童早期至青春期呈進(jìn)行性進(jìn)展，表現(xiàn)為沿blaschko線呈線狀或螺旋狀分布的單發(fā)或多發(fā)、黃褐色、天鵝絨樣、顆粒狀、疣狀斑塊。表皮痣分為角化細(xì)胞型及附屬器型，包括疣狀表皮痣、炎性線狀疣狀表皮痣、皮脂腺痣、黑頭粉刺樣痣、羊毛狀發(fā)痣、小汗腺痣及頂泌汗腺痣。其中，近1/3表皮痣患者可合并系統(tǒng)損害，稱為表皮痣綜合征，包括proteus綜合征、cowden綜合征、child綜合征等，可出現(xiàn)癲癇、腦萎縮、精神障礙、眼部疾病及骨骼畸形等合并癥。

2、表皮痣由胚胎細(xì)胞合子后突變引起，涉及的突變位點(diǎn)多位于ras/mapk信號(hào)通路(hras、kras、nras、braf)、pi3k/akt信號(hào)通路(pik3ca、akt1、pten)、figr信號(hào)通路(fgfr2、fgfr3、egfr)及角蛋白相關(guān)基因(krt1、krt2、krt10、krt16)等。值得注意的是，在表皮痣中存在的體細(xì)胞鑲嵌突變基因與引起部分嚴(yán)重系統(tǒng)疾病的種系突變基因一致，如除導(dǎo)致表皮痣以外，krt1/krt10基因突變還可引起表皮松解性魚鱗病，krt2基因突變還可致淺表性表皮松解性魚鱗病，gjb2基因突變還可引起角膜炎-魚鱗病-耳聾綜合征及vohwinkel綜合征，hras基因突變還可致costello綜合征，fgfr3基因突變可致i型致死性發(fā)育不良病。該現(xiàn)象表明攜帶上述基因體細(xì)胞突變的表皮痣患者如果存在皮膚-生殖腺嵌合情況，則會(huì)將該致病性變異遺傳給下一代，使后代產(chǎn)生更為嚴(yán)重的臨床表型。

3、當(dāng)前，表皮痣的治療存在巨大挑戰(zhàn)，多以激光、手術(shù)等局部對(duì)癥處理為主，容易復(fù)發(fā)。近年來有報(bào)道，mtor拮抗劑西羅莫司成功治療攜帶kras或fgfr3基因鑲嵌突變所致的表皮痣患者，提示基于基因檢測(cè)的靶向治療可能成為未來表皮痣治療的趨勢(shì)，因此，表皮痣的基因檢測(cè)顯得尤為重要。

4、目前，對(duì)于表皮痣的分子診斷缺乏專門的基因檢測(cè)panel，原有基因檢測(cè)主要依賴于全外顯子測(cè)序聯(lián)合sanger測(cè)序驗(yàn)證的方法進(jìn)行致病基因篩選，測(cè)序深度不足，基因覆蓋不全，陽(yáng)性檢出率低且成本較高。表皮痣通常累及表皮，多為體細(xì)胞鑲嵌突變所致，常規(guī)針對(duì)外周血的全外顯子組測(cè)序技術(shù)容易對(duì)其致病基因產(chǎn)生漏診，因此亟需一種可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)表皮痣相關(guān)致病基因的技術(shù)方法，以提高表皮痣及相關(guān)疾病分子診斷陽(yáng)性率，幫助早期診斷、及時(shí)治療和遺傳咨詢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的表皮痣致病基因陽(yáng)性檢出率低、漏診率高的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種能夠提高致病基因陽(yáng)性檢出率、降低檢測(cè)成本的通過靶向高通量深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)診斷表皮痣相關(guān)致病基因的panel，為臨床早期診斷、及時(shí)治療及遺傳咨詢提供依據(jù)。

2、本發(fā)明解決的第一個(gè)技術(shù)問題為：提供了一種表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel，由以下基因組成：krt1、krt2、krt10、krt16、hras、kras、nras、braf、pik3ca、akt1、pten、fgfr2、fgfr3、egfr、gjb2、gja1、nshdl、pmvk、card14、nek9、atp2a2及actb。

3、本發(fā)明根據(jù)22個(gè)表皮痣相關(guān)致病基因，設(shè)計(jì)能覆蓋上述基因外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域的探針池，利用探針靶向捕獲建立含22個(gè)表皮痣相關(guān)致病基因的目標(biāo)區(qū)域文庫(kù)，文庫(kù)利用高通量深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，尋找致病突變，明確表皮痣的遺傳學(xué)病因，為臨床診斷、早期治療及遺傳咨詢提供分子生物學(xué)依據(jù)。

4、其中，上述表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel中，所述krt1在ncbi中的基因id為3848、krt2的基因id為3849、krt10的基因id為3858、krt16的基因id為3868、hras的基因id為3265、kras的基因id為3845、nras的基因id為4893、braf的基因id為673、pik3ca的基因id為5290、akt1的基因id為207、pten的基因id為5728、fgfr2的基因id為2263、fgfr3的基因id為2261、egfr的基因id為1956、gjb2的基因id為2706、gja1的基因id為2697、nshdl的基因id為50814、pmvk的基因id為10654、card14的基因id為79092、nek9的基因id為91754、atp2a2的基因id為488、actb的基因id為60。

5、本發(fā)明解決的第二個(gè)技術(shù)問題為：提供了一種上述表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel在制備輔助診斷表皮痣的試劑盒中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明還提供了一種輔助診斷表皮痣的試劑盒，包括表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel和針對(duì)前述基因檢測(cè)panel的捕獲探針。

7、本發(fā)明還提供了一種使用上述輔助診斷表皮痣的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

8、a、提取受檢者樣本基因組dna；

9、b、構(gòu)建文庫(kù)：對(duì)提取的基因組dna進(jìn)行定量，將基因組dna進(jìn)行片段化，將片段化的基因組dna進(jìn)行末端修復(fù)的同時(shí)進(jìn)行3’末端添加堿基a，將3’末端添加堿基a的產(chǎn)物連接接頭，將連接產(chǎn)物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，加上完整的接頭，使用22個(gè)表皮痣相關(guān)基因探針靶向捕獲目標(biāo)區(qū)域，對(duì)未捕獲的文庫(kù)清洗，保留目標(biāo)區(qū)域文庫(kù)，獲得目標(biāo)區(qū)域捕獲文庫(kù)；

10、c、對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量操作；

11、d、高通量深度測(cè)序，數(shù)據(jù)分析獲得致病位點(diǎn)相關(guān)信息。

12、進(jìn)一步的，所述的方法中，步驟a所述的樣本為受檢者的外周血及組織樣本。

13、進(jìn)一步的，所述的方法中，步驟b所述的定量的方法為熒光定量或電泳方法。

14、進(jìn)一步的，所述的方法中，步驟b所述片段化方法為超聲破碎、轉(zhuǎn)座酶酶切或限制性內(nèi)切酶酶切。

15、本發(fā)明的有益效果：

16、本發(fā)明首次提供了一種表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel，可一次性對(duì)22個(gè)與表皮痣相關(guān)的基因進(jìn)行檢測(cè)，解決了基因覆蓋不全面的技術(shù)問題；應(yīng)用本發(fā)明提供的表皮痣檢測(cè)panel一次性篩查22個(gè)候選基因突變情況，針對(duì)性強(qiáng)、通量高、深度高、速度快，解決了現(xiàn)有技術(shù)中深度不足、檢測(cè)復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力的技術(shù)問題；此外，本發(fā)明的基因檢測(cè)panel方法檢測(cè)成本低、普適性廣，能夠明確表皮痣及相關(guān)疾病的致病基因，探索表皮痣及相關(guān)疾病的遺傳學(xué)病因，幫助患者早期診斷，為后續(xù)基因治療、遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel，其特征在于，由以下基因組成：krt1、krt2、krt10、krt16、hras、kras、nras、braf、pik3ca、akt1、pten、fgfr2、fgfr3、egfr、gjb2、gja1、nshdl、pmvk、card14、nek9、atp2a2及actb。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所示的表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel，其特征在于：所述krt1在ncbi中的基因id為3848、krt2的基因id為3849、krt10的基因id為3858、krt16的基因id為3868、hras的基因id為3265、kras的基因id為3845、nras的基因id為4893、braf的基因id為673、pik3ca的基因id為5290、akt1的基因id為207、pten的基因id為5728、fgfr2的基因id為2263、fgfr3的基因id為2261、egfr的基因id為1956、gjb2的基因id為2706、gja1的基因id為2697、nshdl的基因id為50814、pmvk的基因id為10654、card14的基因id為79092、nek9的基因id為91754、atp2a2的基因id為488、actb的基因id為60。

3.權(quán)利要求1或2所述的表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel在制備輔助診斷表皮痣的試劑盒中的應(yīng)用。

4.一種輔助診斷表皮痣的試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1或2所述的表皮痣相關(guān)致病基因檢測(cè)panel和捕獲探針。

5.一種權(quán)利要求4所述的輔助診斷表皮痣的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的輔助診斷表皮痣的試劑盒的使用方法，其特征在于：步驟a所述的樣本為受檢者的外周血及組織樣本。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的輔助診斷表皮痣的試劑盒的使用方法，其特征在于：步驟b所述的定量的方法為熒光定量或電泳方法。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的輔助診斷表皮痣的試劑盒的使用方法，其特征在于：步驟b所述片段化方法為超聲破碎、轉(zhuǎn)座酶酶切或限制性內(nèi)切酶酶切。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域，具體涉及一種表皮痣相關(guān)的基因檢測(cè)panel及其應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)選22個(gè)表皮痣相關(guān)的致病基因，設(shè)計(jì)探針池，建立針對(duì)表皮痣致病基因的目標(biāo)區(qū)域文庫(kù)，利用高通量深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供的panel可一次性對(duì)多個(gè)與表皮痣相關(guān)的22個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確檢測(cè)低比例嵌合突變，顯著提高表皮痣的突變位點(diǎn)陽(yáng)性檢出率，能夠用于表皮痣及相關(guān)疾病的早期診斷、及時(shí)治療及遺傳咨詢，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的基因檢測(cè)覆蓋不全面、測(cè)序深度不足、漏診率高的技術(shù)問題，具有重要的臨床價(jià)值。本發(fā)明提供的panel具有準(zhǔn)確、快速、靈活、低成本及普適性廣的特點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：李仲桃,汪盛,潘瀟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：四川大學(xué)華西醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/24