本發(fā)明涉及微生物，更具體地說(shuō)，它涉及一種高通量篩選噬菌體的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前我國(guó)海水產(chǎn)品產(chǎn)量呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，但是海水養(yǎng)殖動(dòng)物病害率升高，嚴(yán)重威脅全球海水養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展。哈維氏弧菌(vibrio?harveyi)廣泛分布于海洋及河口，會(huì)引發(fā)石斑魚(yú)(epinephelus)、牙鲆(paralichthys?olivaceus)等多種海洋魚(yú)類(lèi)出血性敗血癥、腸炎和眼部病變等病害，是近年來(lái)海水養(yǎng)殖動(dòng)物病害事件中出現(xiàn)頻率最高的致病菌之一。

2、以往，使用抗生素是應(yīng)對(duì)哈維氏弧菌等致病菌的有效方式，但是如今致病菌產(chǎn)生了耐藥性，而新抗生素的研發(fā)已進(jìn)入瓶頸期。目前替代抗生素治療養(yǎng)殖動(dòng)物的方法還存在產(chǎn)生不良反應(yīng)、治療效果差、藥理不明等諸多缺陷。因此，找到安全、高效應(yīng)對(duì)海水養(yǎng)殖致病菌的新方法，對(duì)于海水養(yǎng)殖動(dòng)物應(yīng)對(duì)致病菌的感染、提高海洋經(jīng)濟(jì)具有重要的意義。

3、為了既能應(yīng)對(duì)當(dāng)前嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，又能推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖按照“提質(zhì)增效、綠色發(fā)展”的要求發(fā)展。一種早于抗生素，在一百年前就被發(fā)現(xiàn)可以裂解細(xì)菌的噬菌體，又意外的被學(xué)者們重新重視起來(lái)。與抗生素相比，在海水養(yǎng)殖中使用噬菌體具有的優(yōu)勢(shì)：1)具有專(zhuān)一性，不會(huì)影響環(huán)境中的其它微生物；2)易被生物降解，不易在環(huán)境中殘留使致病菌產(chǎn)生耐藥；3)噬菌體在水體環(huán)境中普遍存在。但是，特別針對(duì)于海洋弧菌有良好的噬菌體分離體系缺乏，使得噬菌體的分離過(guò)程繁雜，成本高，猶如大海撈針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種高通量篩選噬菌體的方法及應(yīng)用，可應(yīng)用此方法篩選到哈維氏弧菌的噬菌體，且能縮減將宿主菌與待篩選水體預(yù)孵育的步驟提高效率，并且減少成本，提高準(zhǔn)確性。

2、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種高通量篩選噬菌體的方法及應(yīng)用，包括以下步驟：

3、s1、將所有待測(cè)水樣分裝到5ml離心管中離心，轉(zhuǎn)速為14000r/min；

4、s2、每個(gè)樣品取3ml上清液，每5個(gè)樣品混合，取3ml混合后的水樣與100μl待測(cè)宿主菌液和3ml雙倍液體培養(yǎng)基混合液于試管中，在適宜溫度下振蕩培養(yǎng)；

5、s3、培養(yǎng)結(jié)束后離心過(guò)濾去除宿主菌，將噬菌體原液100ul與其對(duì)應(yīng)的菌液100ul混合，檢測(cè)上清液中是否有噬菌體，分離得到噬菌體；

6、s4、用雙層平板法制作培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上的每個(gè)噬菌體斑戳出多個(gè)小孔，加入至含有200ul?sm緩沖溶液的96孔板里，獲得噬菌體庫(kù)；

7、s5、噬菌體庫(kù)每孔取5μl噬菌體液，點(diǎn)在一塊含有菌苔的方形培養(yǎng)皿上，觀察噬菌斑的情況；

8、s6、將透亮明顯的噬菌體斑進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

9、進(jìn)一步的，步驟s3中所述的宿主菌為待篩選噬菌體裂解菌。

10、進(jìn)一步的，步驟s4中所述的培養(yǎng)基為含有35％nacl的lb培養(yǎng)基。

11、一種高通量篩選噬菌體的方法篩選出的噬菌體在分散劑、穩(wěn)定劑、填料或溶劑中的應(yīng)用。

12、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

13、(1)本發(fā)明提供篩選噬菌體的方法，對(duì)雙層平板法和直接點(diǎn)滴法的改進(jìn)，解決了傳統(tǒng)方法僅能對(duì)宿主菌篩選一種水樣的問(wèn)題；且相對(duì)于傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，該方法僅需要12～24h方可完成一次批量測(cè)試測(cè)定，縮短了噬菌體篩選的時(shí)間；

14、(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用一個(gè)平板就可以進(jìn)行批量篩選，節(jié)約了噬菌體篩選的成本，而且容易觀察并記錄，僅需一張照片就可將實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰的記錄下來(lái)，且可在方板上進(jìn)行編號(hào)，方便確定不同噬菌體斑的來(lái)源。

技術(shù)特征：

1.一種高通量篩選噬菌體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量篩選噬菌體的方法，其特征在于，步驟s3中所述的宿主菌為待篩選噬菌體裂解菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量篩選噬菌體的方法，其特征在于，步驟s4中所述的培養(yǎng)基為含有35％nacl的lb培養(yǎng)基。

4.基于權(quán)利要求1所述的一種高通量篩選噬菌體的方法篩選出的噬菌體在分散劑、穩(wěn)定劑、填料或溶劑中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高通量篩選噬菌體的方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供的篩選弧菌噬菌體的方法，可以高通量篩選噬菌體，治療弧菌感染引起的疾病，在復(fù)雜細(xì)菌的環(huán)境中不會(huì)對(duì)環(huán)境微生物造成傷害，篩選噬菌體的效率高，大規(guī)模生產(chǎn)成本低，效果好。本發(fā)明提供篩選弧菌噬菌體的方法可以選擇不同地區(qū)、多水體樣品，針對(duì)性的篩選對(duì)耐藥菌有高裂解性的噬菌體。避免了傳統(tǒng)篩選噬菌體對(duì)單一水體的篩選，平行組之間不平等的對(duì)照和比較，擴(kuò)大了噬菌體的篩選范圍和提高了準(zhǔn)確性，具有快速高效獲得宿主菌噬菌體的特點(diǎn)，并且起到了節(jié)約成本的作用。

技術(shù)研發(fā)人員：冀霞,李瑋瑋,蔡天舒,張婷,田鈺芳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：惠州學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10