本發(fā)明涉及固定化酶工程，具體涉及一種雜化水凝膠固定雙酶級聯(lián)反應(yīng)器及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、多酶級聯(lián)反應(yīng)是指由多種酶協(xié)同參與逐級催化的過程，前一種酶催化形成的產(chǎn)物(或中間體)可作為后續(xù)酶的底物繼續(xù)參與下一步酶催化反應(yīng)。多酶級聯(lián)反應(yīng)的中間產(chǎn)物在不同酶的活性位點之間轉(zhuǎn)運，可以保持中間體的高局部濃度，以及減少物質(zhì)輸送過程中的擴散損失，實現(xiàn)了特異、專一、高效的催化反應(yīng)。受此啟發(fā)，人們將不同功能的多種酶通過物理、化學(xué)或生物方法限制或定位于特定的載體表面或內(nèi)部，依據(jù)多酶級聯(lián)反應(yīng)的高效協(xié)同催化機理而構(gòu)建了固定化多酶級聯(lián)反應(yīng)器。其綜合了多酶級聯(lián)反應(yīng)的協(xié)同高效性和固定化酶優(yōu)良的穩(wěn)定性、可重復(fù)使用性，可將不同酶的催化特性結(jié)合起來，增加酶周圍的反應(yīng)物濃度，從而顯著地提高酶催化效率。其中葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶因其原料簡單、多種條件下能穩(wěn)定進行級聯(lián)反應(yīng)常被用來構(gòu)建的固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器。

2、適宜的固定化載體和固定化工藝是構(gòu)建高活性和高協(xié)同性雙酶級聯(lián)反應(yīng)器的基礎(chǔ)。金屬有機框架(mof)是由金屬陽離子簇與具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的有機配體配位而成，具有高結(jié)晶度和孔隙率。在各種mof材料中，zif-8由于其溫和的合成條件，良好的水熱穩(wěn)定性，大的比表面積和可調(diào)節(jié)的孔徑，在酶固定化如包封、孔吸附方面具有重要的應(yīng)用前景，成為酶固定化的常用新型載體材料。但是大多zif材料在酸性環(huán)境下會被逐漸降解，并喪失其多孔結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其中固定化的酶泄露，且粉末形式存在的zif-8固定化酶在使用過程難以分離重復(fù)使用。

3、高分子水凝膠因其優(yōu)異的酶相容性、刺激響應(yīng)性和結(jié)構(gòu)的靈活多變被認為是固定化酶的理想載體材料。水凝膠固定化酶可為其內(nèi)部固定化的酶提供親水微環(huán)境而保持酶的活性，并可通過外界刺激來改變其親疏水性或體積來調(diào)控固定化酶的活性。但傳統(tǒng)的水凝膠固定化酶制備過程使用的化學(xué)交聯(lián)方法會破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，從而降低酶的活性。

4、因此，需開發(fā)一種新的雜化水凝膠固定化酶級聯(lián)反應(yīng)器，能夠?qū)Χ嗝高M行原位固定，且能夠保留多酶活性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在提供一種雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器及其制備方法與應(yīng)用，級聯(lián)反應(yīng)器中包括反應(yīng)核及所述反應(yīng)核表面的水凝膠層；所述反應(yīng)核包括包裹在zif-8中的組合酶；所述水凝膠層包括雜化水凝膠；所述雜化水凝膠通過gox在o2存在下氧化葡萄糖反應(yīng)生成h2o2，生成的h2o2傳遞給hrp催化底物acac產(chǎn)生acac自由基，從而引發(fā)單體與交聯(lián)劑發(fā)生自由基共聚合形成包裹zif-8復(fù)合物的雜化水凝膠三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器，所述雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器中包括反應(yīng)核及所述反應(yīng)核表面的雜化水凝膠層；

3、所述反應(yīng)核包括固定化雙酶zif-8復(fù)合物；

4、所述固定化雙酶zif-8復(fù)合物包括zif-8、包裹在zif-8中的組合酶。

5、可選地，所述組合酶包括葡萄糖氧化酶/辣根過氧化物酶、吡喃糖氧化酶/辣根過氧化物酶中任意一種。

6、可選地，所述雜化水凝膠層包括單體自由基聚合物。

7、可選地，所述單體包括水溶性單體；所述水溶性單體包括n,n-二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇丙烯酸酯、丙烯酸羥乙酯中任意一種。

8、第二方面，本發(fā)明提供一種雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器的制備方法，包括以下步驟：

9、在硝酸鋅溶液中，加入所述組合酶，2-甲基咪唑，攪拌2-4h，離心，洗滌，干燥后制得固定化雙酶zif-8復(fù)合物；

10、所述硝酸鋅中鋅離子與2-甲基咪唑摩爾比1：4；所述組合酶中兩種酶的質(zhì)量比為(1-2)：(1-3)；

11、在水中，所述組合酶的催化下，交聯(lián)劑作用下，固定化雙酶zif-8復(fù)合物與所述單體、底物，聚合制得雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器；所述底物包括葡萄糖、乙酰丙酮。

12、可選地，所述雜化水凝膠的形成包括以下步驟：

13、葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成h2o2，再將h2o2傳遞給hrp，從而hrp催化acac產(chǎn)生acac自由基；acac自由基與水溶性單體與交聯(lián)劑發(fā)生自由基共聚合形成雜化水凝膠三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

14、可選地，所述交聯(lián)劑包括改性二氧化硅納米粒子、n,n-亞甲基雙丙烯酰胺中的任意一種。

15、可選地，所述固定化雙酶zif-8復(fù)合物與所述單體的質(zhì)量比1：(10-100)。

16、可選地，所述交聯(lián)劑的質(zhì)量為單體質(zhì)量的1％-4％。

17、可選地，所述葡萄糖在水中的濃度為5-20mmol/l。

18、可選地，所述乙酰丙酮在水中的濃度為0.1-1mmol/l。

19、可選地，所述組合酶的催化下的條件包括：溫度為30℃。

20、第三方面，本發(fā)明提供一種雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器在廢水處理中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括降解廢水中的酚類化合物。

21、可選地，所述酚類化合物包括苯酚、雙酚a、4-氯苯酚、阿魏酸、咖啡酸中至少一種。

22、可選地，所述雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器具有良好的重復(fù)使用性；重復(fù)使用5次后，所述級聯(lián)反應(yīng)器的相對于第一次使用的活性下降至20％。

23、本發(fā)明具備的有益效果包括：

24、(1)本發(fā)明提供的級聯(lián)反應(yīng)器的制備方法，通過仿生礦化法以zif-8包埋雙酶，能夠?qū)崿F(xiàn)酶比例可控的高效固定化，且能有效保留雙酶活性；且本發(fā)明外層的雜化水凝膠，通過固定化雙酶本身的級聯(lián)反應(yīng)來酶催化水溶性單體聚合原位構(gòu)建的，不需要嚴(yán)苛的反應(yīng)條件和外加的反應(yīng)試劑，在酶催化聚合過程中同時實現(xiàn)了雜化水凝膠網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和固定化雙酶的原位無損害包埋，避免了常規(guī)自由基聚合反應(yīng)體系易導(dǎo)致酶構(gòu)型變化甚至活性降低的問題，方法簡單，條件溫和，易于實現(xiàn)；

25、(2)本發(fā)明提供的雜化水凝膠，使用zif-8和kh570-sio2納米粒子改善雜化水凝膠的交聯(lián)密度和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有效地提升雜化水凝膠的機械強度，且能夠提升包埋在其中的zif-8的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，解決其在酸性溶液中易降解導(dǎo)致固定化酶泄露的問題，同時為固定化雙酶提供親水微環(huán)境，提升雙酶級聯(lián)反應(yīng)的活性；

26、(3)本發(fā)明提供的雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器能有效地富集水中的酚類化合物，從而提高酚類化合物在固定化雙酶附近的局部濃度，提升雙酶級聯(lián)反應(yīng)催化降解酚類化合物的效率，具有高效性和環(huán)境友好性，對酚類化合物有很好的降解效果，且其產(chǎn)物無毒或低毒，符合綠色化學(xué)理念，可應(yīng)用于含酚類化合物廢水的高效處理。

技術(shù)特征：

1.一種雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器，其特征在于，所述雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器中包括反應(yīng)核及所述反應(yīng)核表面的雜化水凝膠層；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器，其特征在于，所述組合酶包括葡萄糖氧化酶/辣根過氧化物酶、吡喃糖氧化酶/辣根過氧化物酶中任意一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器，其特征在于，所述雜化水凝膠層包括單體自由基聚合物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器，其特征在于，所述單體包括水溶性單體；所述水溶性單體包括n,n-二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇丙烯酸酯、丙烯酸羥乙酯中任意一種。

5.一種如權(quán)利要求1-4任一項所述雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑包括改性二氧化硅納米粒子、n,n-亞甲基雙丙烯酰胺中的任意一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述固定化雙酶zif-8復(fù)合物與所述單體水溶液中的單體的質(zhì)量比1：(10-100)。

8.一種如權(quán)利要求1-4任一項所述雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器在廢水處理中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括降解所述廢水中的酚類化合物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述酚類化合物包括苯酚、雙酚a、4-氯苯酚、阿魏酸、咖啡酸中至少一種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器及其制備方法與應(yīng)用。采用仿生礦化法制備包埋組合酶的金屬有機框架復(fù)合物，將其分散于水溶性單體中，利用組合酶級聯(lián)反應(yīng)酶催化單體聚合在雜化水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的同時實現(xiàn)對雙酶無損害的原位固定化，獲得固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器。本發(fā)明制備的雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器酶固定化率高、酶穩(wěn)定性好、雙酶固定化比例可控、操作簡單、條件溫和，易于實現(xiàn)；本發(fā)明制得的雜化水凝膠固定化雙酶級聯(lián)反應(yīng)器具有吸附和降解功能，可有效地富集水中的酚類化合物，提高酚類化合物在固定化雙酶附近的局部濃度，提升雙酶級聯(lián)反應(yīng)催化降解酚類化合物的效率，可應(yīng)用于含酚類化合物廢水的高效處理。

技術(shù)研發(fā)人員：彭志平,藍麗青,廖曦
受保護的技術(shù)使用者：南昌大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10