本發(fā)明屬于生物，具體內(nèi)容涉及一株青霉素酰化酶的生產(chǎn)菌株、青霉素?；负屯蛔凅w以及在酶法合成β-內(nèi)酰胺抗生素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、青霉素?；?penicillin?acylase，pga)，又稱為青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。主要來自大腸埃希氏菌和巨大芽孢桿菌胞，該酶已大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵中間體和半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素。該酶在酸性及中性條件下可用于催化6-氨基青霉素酸(6-apa)、7-氨基頭孢烷酸(7-aca)或7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-adca)與?；w發(fā)生?；磻?yīng)，制備半合成抗生素；而在偏堿性條件下，可催化青霉素鉀鹽、頭孢菌素鈉鹽等水解成6-apa、7-adca或7-aca，而6-apa和7-adca(7-aca)是制備半合成抗生素的重要母核，可以制備高效、廣譜新型內(nèi)酰胺類抗生素。因此，青霉素?；甘枪I(yè)上應(yīng)用價(jià)值很高的酶。

2、頭孢菌素是β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有很高的療效，通常用于治療輕至嚴(yán)重的感染性疾病。根據(jù)2004年至2014年醫(yī)療保健數(shù)據(jù)庫(kù)的記錄，美國(guó)頭孢菌素的處方數(shù)量(占抗生素總量的47.5％)超過了窄譜和廣譜青霉素的數(shù)量(占抗生素總量的39.7％)(bush?andbradford.β-lactams?andβ-lactamase?inhibitors:an?overview.)。半合成頭孢菌素對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有廣泛的活性，它們是基于雙環(huán)核合成的，雙環(huán)核由一個(gè)六元二氫噻嗪環(huán)和一個(gè)β-內(nèi)酰胺環(huán)連接而成。頭孢菌素骨架的兩個(gè)碳，c3和c7，為引入可變側(cè)鏈提供了巨大的可能性，從而顯著擴(kuò)展抗菌活性并增強(qiáng)針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

3、而頭孢拉定為第一代半合成頭孢菌素，抗菌作用與頭孢氨芐相似。本品耐酸可以口服，吸收好，血藥濃度較高，特點(diǎn)是耐β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)耐藥性強(qiáng)的金葡萄球菌及其它多種對(duì)廣譜抗生素耐藥的桿菌等有迅速而可靠的殺菌作用。具現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，頭孢拉定的酶法催化合成活力無法滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。因此，挖掘性能優(yōu)良的青霉素?；?，如ph耐受性好、合成底物范圍廣泛，熱穩(wěn)定性更高的菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)提供更好的選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開了一種青霉素?；干a(chǎn)菌株，該青霉素?；副磉_(dá)載體構(gòu)建和該酶在大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)中的異源表達(dá)獲得重組酶，該青霉素?；负铣?-apa、7-aca、7-adca為母核的β-內(nèi)酰胺類抗生素。

2、本發(fā)明提供一種青霉素?；富蚱渫蛔凅w，其來自于克雷伯氏菌klebsiellasp.wp8-s18-esbl-06，所述青霉素?；妇哂衧eq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述突變體在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：s356、i466、a72、s175、r171、a72、s290、r171、a72、s290、r171、a109、s290、f172、m168、y316、f360、m168、y316、f360、f313?y316、f360、f313、l542、r409、h481、f545、r409、y537、f545、f748、f543、f545、f748、y628、l546、f748、a651、l546、544h、t770、l546、679e、544h、664c、679c、544h、666h、679a。

3、優(yōu)選地，所述突變體在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：m168f/f313g、m168g/y316c、m168g/f360g、m168g/r409h、m168g/f545g、m168g/f748s、m168g/t770a、f313g/y316c、f313g/f360g、f313g/r409h、f313g/f545e、f313g/f748s、f313g/t770a、y316c/f360g、y316c/r409h、y316c/f748s、y316c/t770a、f360g/r409h、f360g/f545e、f360g/f748s、f360g/t770a、r409h/f545e、r409h/f748s、r409h/t770a、f545e/f748s、f545e/t770a、f748s/t770a。

4、本發(fā)明提供一種包括所述的青霉素?；富蚱渫蛔凅w的編碼核酸，所述核酸是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸是rna，如mrna或hnrna。

5、本發(fā)明進(jìn)一步提供包括所述的編碼基因的重組載體。具體地，其出發(fā)載體是pet-28a。

6、本發(fā)明提供包括所述重組載體的重組菌株。具體地，其是大腸桿菌，更具體的是將所述核酸與載體pet-28a構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)所得。

7、本發(fā)明進(jìn)一步提供所述一種青霉素酰化酶或其突變體在合成β-內(nèi)酰胺抗生素，例如頭孢拉定中的應(yīng)用。

8、具體地，所述青霉素?；负铣梢?-apa、7-aca或7-adca為母核的頭孢菌素類抗生素。

9、本發(fā)明也提供一種制備β-內(nèi)酰胺類抗生素的方法，其包括：以β-內(nèi)酰胺類抗生素6-apa、7-aca、7-adca為底物，利用所述權(quán)利要求6所述重組菌株的細(xì)胞或其裂解產(chǎn)物進(jìn)行催化反應(yīng)，得到β-內(nèi)酰胺類抗生素；

10、所述催化反應(yīng)的溫度為10-40℃，具體為15℃；所述反應(yīng)的ph?6.5～9.5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行的，具體ph?6.5至7.5，更具體為ph7.0；

11、反應(yīng)時(shí)間為0.5-24小時(shí)，具體為1小時(shí)。

12、本發(fā)明首先挖掘出了來源于klebsiella?sp.wp8-s18-esbl-06的青霉素?；缚捎糜诖呋?內(nèi)酰胺類抗生素母核7-adca、7-aca、6-apa合成β-內(nèi)酰胺類抗生素。更進(jìn)一步地，本發(fā)明所提供的青霉素?；妇?，具有較為廣泛的底物譜，在生物催化制備β-內(nèi)酰胺類抗生素中具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種青霉素?；富蚱渫蛔凅w，其特征在于該酶來自于克雷伯氏菌klebsiella?sp.?wp8-s18-esbl-06，所述青霉素?；妇哂衧eq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述突變體在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：s356、i466、a72、s175、r171、a72?、s290、r171、a72?、s290、r171、a109、s290、f172、m168、y316、f360、m168、y316、f360、f313?y316、f360、f313、l542、r409、h481、f545、r409、y537、f545、f748、f543、f545、f748、y628、l546、f748、a651、l546、544h、t770、l546、679e、544h、664c、679c、544h、666h、679a。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述青霉素?；富蚱渫蛔凅w，其特征在于，所述突變體在seq?idno.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：m168f/f313g、m168g/y316c、m168g/f360g、m168g/r409h、m168g/f545g、m168g/f748s、m168g/t770a、f313g/y316c、f313g/f360g、f313g/r409h、f313g/f545e、f313g/f748s、f313g/t770a、y316c/f360g、y316c/r409h、y316c/f748s、y316c/t770a、f360g/r409h、f360g/f545e、f360g/f748s、f360g/t770a、r409h/f545e、r409h/f748s、r409h/t770a、f545e/f748s、f545e/t770a、f748s/t770a。

3.一種包括權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的青霉素?；富蚱渫蛔凅w的編碼核酸，所述核酸是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸是rna，如mrna或hnrna。

4.包括權(quán)利要求3所述的編碼核酸的重組載體。

5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，其出發(fā)載體是pet-28a。

6.包括權(quán)利要求4或5所述重組載體的重組菌株。

7.如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，其是大腸桿菌，更具體的是將權(quán)利要求3所述編碼核酸與載體pet-28a構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21（de3）所得。

8.權(quán)利要求1或2所述一種青霉素酰化酶或其突變體在合成β-內(nèi)酰胺抗生素，例如頭孢拉定中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述青霉素?；负铣梢?-apa、7-aca或7-adca為母核的頭孢菌素類抗生素。

10.一種制備β-內(nèi)酰胺類抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括：以β-內(nèi)酰胺類抗生素6-apa、7-aca、7-adca為底物，利用權(quán)利要求6所述重組菌株的細(xì)胞或其裂解產(chǎn)物進(jìn)行催化反應(yīng)，得到β-內(nèi)酰胺類抗生素；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了青霉素?；富蚱渫蛔凅w，構(gòu)建的菌株，以及酶法合成β?內(nèi)酰胺抗生素的方法。本發(fā)明獲得的青霉素酰化酶可催化β?內(nèi)酰胺抗生素母核與?；w發(fā)生酰基化反應(yīng)，用于制備β?內(nèi)酰胺類抗生素，在生物酶法催化頭孢類藥物中間體的合成中具有良好工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：孫周通,袁波,劉玲怡,李湘瑩,曲戈
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19