本發(fā)明屬于分子標記的，具體涉及gdf10基因片段作為影響綿羊尾部脂肪沉積性狀的分子標記及其在綿羊育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、湖羊是綿羊的一種，作為原產(chǎn)于我國的短肥尾品種，因其繁殖性能高、生長快、適應(yīng)性強、性成熟早、常年發(fā)情、產(chǎn)羔量大、泌乳能力強等特點，受到廣大養(yǎng)殖戶的廣泛歡迎。隨著室內(nèi)養(yǎng)羊生產(chǎn)系統(tǒng)的發(fā)展以及人們消費觀念的改變，尾脂的過度沉積限制了羔羊的商業(yè)價值，肥尾已成為一種不太受歡迎和不太必要的特征。尾脂重占胴體重的比例是影響胴體質(zhì)量的重要指標，尾脂沉積過多會降低飼料轉(zhuǎn)化率，增加飼養(yǎng)成本、影響家畜肉質(zhì)、動物的交配以及正常運動。因此，降低湖羊尾部脂肪的沉積勢在必行。

2、gdf10(生長分化因子10)又稱為骨形態(tài)發(fā)成蛋白3b(bmp-3b)，是bmp家族中的一員，是一種重要的生長因子蛋白。gdf10基因編碼蛋白質(zhì)tgf-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β)超家族的分泌配體，結(jié)合各種tgf-β受體，導(dǎo)致調(diào)節(jié)基因表達的smad家族轉(zhuǎn)錄因子的募集和激活。該基因編碼的前原蛋白經(jīng)過蛋白水解處理產(chǎn)生與二硫鍵連接的同型二聚體的亞基，這促進了中風后的神經(jīng)修復(fù)。這種蛋白還可能充當腫瘤抑制因子，并且該基因的表達降低與口腔癌有關(guān)。此外，該基因參與成骨和脂肪生成，在通過smad2/3通路的成骨細胞分化過程中起抑制作用，并在脂肪生成過程中起抑制作用。akiyoshi?uezumi等的研究表明bmp3b在間充質(zhì)祖細胞中特異性表達，其表達水平在衰老或脂肪形成分化過程中顯著降低。tamana?ryousof等的研究表明，bmi升高的兒童血漿gdf10水平明顯降低(p<0.05)，這表明肥胖兒童血漿中g(shù)df10水平較低，揭示了導(dǎo)致兒童肥胖的潛在機制。目前，gdf10基因在綿羊尾部脂肪沉積中的作用機制尚未見報道，其功能也尚不清楚，gdf10基因與綿羊尾部脂肪沉積是否相關(guān)也不清楚。本發(fā)明通過對gdf10基因進行測序和分析，探討其不同基因型與綿羊尾部脂肪沉積性狀之間的關(guān)聯(lián)，旨在為降低綿羊尾部脂肪沉積的遺傳改良方面提供基因素材，加速自主知識產(chǎn)權(quán)的低尾脂型優(yōu)質(zhì)肉羊新品種的培育進程。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種作為與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的分子標記是從綿羊gdf10基因中擴增得到，其具體核苷酸序列如seq?idno.1所示。通過擴增綿羊gdf10基因的dna序列并測序，尋找gdf10基因的多態(tài)性位點，分析不同的基因型與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)性，并建立含多態(tài)性位點的分子標記的檢測方法，并可將該分子標記應(yīng)用于降低綿羊的尾部脂肪沉積新品種的培育中。

3、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案為：

4、一種與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記在育種中的應(yīng)用，所述分子標記的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其中第614bp位的w表示a或t，由于上述序列在第614位堿基處有一個a/t突變，從而導(dǎo)致了綿羊gdf10基因在該位點的a/t多態(tài)性。

5、檢測上述與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的引物對在綿羊育種中的應(yīng)用，所述引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

6、檢測上述與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的aqp?snp引物對在綿羊育種中的應(yīng)用，所述aqp?snp引物對包括檢測allelea的正向引物、檢測allelet的正向引物和通用反向引物，其中，檢測allelea的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，測allelet的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，通用反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

7、檢測上述與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的試劑盒在綿羊育種中的應(yīng)用，所述試劑盒包含了檢測上述分子標記的pcr引物對或aqp?snp引物對。

8、檢測與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的方法，具體檢測方法包括如下步驟：

9、s1、使用上述的pcr引物對、aqp?snp引物對或包含上述引物對的試劑盒，對綿羊基因組dna進行擴增；

10、s2、對步驟s1獲得的擴增產(chǎn)物的多態(tài)性位點進行鑒定。

11、其中，在步驟s2中，上述分型鑒定的方法包括但不限于直接測序法、熒光探針法、基因芯片法、高分辨率溶解曲線法。

12、利用上述引物對檢測與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)分子標記的方法，包括如下步驟：

13、a)以綿羊血液為樣品提取基因組dna，利用核苷酸序列如seq?id?no.4、seq?idno.5和seq?id?no.6所示的引物對進行aqp分型；

14、b)擴增結(jié)束后，利用c1000?touch?thermal?cycler儀器檢測熒光信號并查看分型結(jié)果。

15、如上述所述的檢測方法在綿羊尾部脂肪沉積性狀檢測中的應(yīng)用，通過在待測綿羊的基因組dna中檢測本發(fā)明的分子標記，并分析多態(tài)性位點的類型，從而可以確定綿羊尾部脂肪的高低，進而篩選出尾部脂肪沉積較少的綿羊品種，攜帶at基因型羊尾脂相對胴體重顯著低于攜帶aa基因型的羊，攜帶at基因型羊的尾部脂肪沉積低于攜帶aa和tt基因型的羊。

16、如上所述的檢測方法在綿羊育種中的應(yīng)用，所述育種為選育出低尾脂型的綿羊品種，若待檢樣品的基因型為at型，則該基因型的羊為低尾脂型。攜帶at基因型羊的尾部脂肪沉積低于攜帶aa和tt基因型的羊，留選基因型為at型用于育種。

17、本發(fā)明通過對綿羊代表品種湖羊的gdf10基因進行pcr擴增和測序，發(fā)現(xiàn)在擴增片段的第614位存在一個a/t多態(tài)性位點，并通過檢測795只湖羊多態(tài)性和建立的最小二乘模型，確定了一種與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記，該分子標記可以用于低尾脂沉積性狀型綿羊的選育，為綿羊尾部脂肪沉積性狀的遺傳改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的實際應(yīng)用價值。

18、本發(fā)明的有益效果在于：

19、本發(fā)明提供了與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記在綿羊育種中的應(yīng)用，分子標記的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其中第614bp位的w表示a或t，攜帶at基因型的羊尾脂相對胴體重顯著低于aa基因型；攜帶at基因型為低尾脂型，在育種時可選留at基因型。通過檢測該多態(tài)性位點的基因型來有效鑒別是否為低尾脂型的綿羊，為低尾脂型綿羊的選育提供有效的檢測手段。

20、本發(fā)明還建立了與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記多態(tài)性位點的檢測方法，可確定待測綿羊的多態(tài)性位點的基因型，可用于選留基因為aa純合型綿羊作為種羊用于育種，用以降低尾部脂肪的沉積，提高綿羊的品質(zhì)，有助于提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益。

技術(shù)特征：

1.一種與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記在綿羊育種中的應(yīng)用，其特征在于，分子標記的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其中第614bp處的w表示a或t，該突變導(dǎo)致分子標記的a/t多態(tài)性。

2.檢測與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的引物對在綿羊育種中的應(yīng)用，其特征在于，引物對包括引物r-f和引物r-r，引物r-f的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，引物r-r的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

3.檢測與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的aqp?snp引物對在綿羊育種中的應(yīng)用，aqp?snp引物對包括檢測allelea的正向引物、檢測allelet的正向引物和通用反向引物，其中，檢測allelea的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，測allelet的正向引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，通用反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

4.檢測與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的檢測試劑盒在綿羊育種中的應(yīng)用，其特征在于，檢測試劑盒包含引物對或aqp?snp引物對，其中，引物對包括引物r-f和引物r-r，引物r-f的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，引物r-r的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

5.檢測與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的方法，其特征在于，所述分子標記的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其中第614bp位的w表示a或t，檢測方法包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟s2中的分型鑒定方法為測序法、基因芯片法、熒光探針法或高分辨率溶解曲線法。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用aqp?snp引物對進行pcr擴增時，擴增結(jié)束后，利用c1000?touch?thermal?cycler儀器檢測熒光信號并查看分型結(jié)果。

8.權(quán)利要求5-7任一項所述的方法在綿羊尾部脂肪沉積性狀檢測中的應(yīng)用，用于篩選出尾部脂肪沉積較少的小尾型的綿羊品種，攜帶at基因型羊尾脂相對胴體重顯著低于攜帶aa基因型的羊。

9.權(quán)利要求5-7中任一項所述的方法在綿羊育種中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，其育種目的是為挑選出低尾脂型綿羊。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記在育種中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對綿羊GDF10基因進行PCR擴增和序列分析，發(fā)現(xiàn)在擴增片段的第614位存在一個A/T多態(tài)性位點，進一步使用AQP引物對對795只湖羊的多態(tài)性位點進行檢測和建立最小二乘模型，對基因型與尾部脂肪沉積性狀進行關(guān)聯(lián)分析，最終確定了本發(fā)明擴增的GDF10基因片段可以作為與綿羊尾部脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記。本發(fā)明通過檢測分子標記可用于育種中選育低尾脂型的綿羊，可選留AT雜合型綿羊進入核心群用于育種，可用于降低綿羊的尾部脂肪沉積，有助于增加經(jīng)濟效益。

技術(shù)研發(fā)人員：王維民,閆成琪,田慧彬,趙源,張煜坤,李曉龍
受保護的技術(shù)使用者：蘭州大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10