本發(fā)明屬于萜烯生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種益智來(lái)源的α-石竹烯合成酶aohs1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、益智(拉丁學(xué)名：alpinia?oxyphylla?miq.)，別名：益智仁、益智子，是一種姜科山姜屬草本植物。從益智果實(shí)不同部位提取的精油作為一種重要的成分，含有多種天然化合物，具有多種藥用價(jià)值。迄今為止，在益智中發(fā)現(xiàn)的主要化合物有萜類、酚類和留醇類，其中萜類物質(zhì)是從益智果實(shí)中分離鑒定出的重要成分。

2、萜類化合物是植物中數(shù)量最多、種類最豐富的次生代謝物之一，其基本組成單元為異戊二烯(c5h8)，根據(jù)異戊二烯的數(shù)量，萜類化合物分為半萜(c5)、單萜(c10)、倍半萜(c15)、雙萜(c20)、雙倍半萜(c25)、三萜(c30)、四萜(c40)和多萜。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，萜類化合物在實(shí)際生產(chǎn)中具有廣泛的用途，被開發(fā)成天然香料、燃料、食品添加劑、治療劑、代謝調(diào)節(jié)劑和殺蟲劑等，另外臨床上已證明一些萜類具有神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)記憶、抗菌消炎、改善呼吸功能、刺激心臟和鎮(zhèn)靜催眠等藥理作用。

3、石竹烯是一種倍半萜類化合物，由于具有抗炎和抗癌等生物活性，已被用于制藥工業(yè)。當(dāng)前，石竹烯的生產(chǎn)主要來(lái)源于植物提取，但是植物提取法受限于氣候、產(chǎn)量、成本等因素而導(dǎo)致價(jià)格居高不下，隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，以微生物生產(chǎn)石竹烯被認(rèn)為是一種綠色、可持續(xù)的生產(chǎn)方式。石竹烯合成酶是石竹烯合成途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化底物法尼基焦磷酸(fpp)生成石竹烯，微生物生物合成方法就需要引入合成途徑中的關(guān)鍵酶α-石竹烯合成酶/β-石竹烯合成酶。目前已鑒定的α-石竹烯合成酶/β-石竹烯合成酶數(shù)量有限，因此需要挖掘更多的酶以供研究人員利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種益智來(lái)源的新α-石竹烯合成酶aohs1及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了一種益智來(lái)源的α-石竹烯合成酶aohs1，aohs1包含萜類合成酶特有的一段富含天冬氨酸的保守序列dd××d，并將其與來(lái)源于紅球姜的α-石竹烯合成酶zss1通過(guò)blast進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)aohs1與zss1的序列相似度為83.3％(圖3)。其中，zss1的氨基酸序列如b1b1u3.1所示，核苷酸序列如ab247331.1所示。本發(fā)明對(duì)α-石竹烯合成酶aohs1進(jìn)行了功能表征，并且提供了aohs1在釀酒酵母合成石竹烯中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種益智來(lái)源的α-石竹烯合成酶aohs1，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、一種所述α-石竹烯合成酶aohs1的編碼基因，優(yōu)選的，其核苷酸序列如seq?idno.1所示。

6、所述基因可賦予益智種子倍半萜α-石竹烯成分。該基因序列包含萜類合成酶特有的一段富含天冬氨酸的保守序列dd××d，屬于植物萜類合成酶，它與數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)源于姜科植物紅球姜的倍半萜合成酶α-石竹烯合成酶相似度最高，氨基酸序列相似性為83.3％。

7、上述α-石竹烯合成酶aohs1相關(guān)的生物材料，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：

8、(a)含有上述編碼基因的表達(dá)盒；

9、(b)含有上述編碼基因的重組表達(dá)載體；

10、(c)含有(a)中所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體；

11、(d)含有上述編碼基因的重組微生物；

12、(e)含有(a)中所述表達(dá)盒的重組微生物；

13、(f)含有(b)或(c)中所述重組表達(dá)載體的重組微生物。

14、進(jìn)一步的，(a)中所述表達(dá)盒還包括啟動(dòng)子、終止子；所述啟動(dòng)子為啟動(dòng)子ccw12(ccw12p)等，所述終止子為終止子cyc1(cyc1t)等。

15、進(jìn)一步的，(b)、(c)中所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為yep型載體等；優(yōu)選為yep352載體。

16、進(jìn)一步的，(d)、(e)、(f)中所述重組微生物對(duì)應(yīng)的宿主微生物選自原核生物或酵母等；所述原核生物包括埃希氏菌屬(escherichia)等細(xì)菌；所述酵母包括釀酒酵母等酵母。更具體而言，所述原核生物是大腸桿菌(escherichia?coli，e.coli)，具體可為大腸桿菌bl21(de3)；所述酵母是釀酒酵母cen.pk2-1ca菌株，或者，以釀酒酵母cen.pk2-1ca菌株為出發(fā)菌株構(gòu)建的產(chǎn)前體物質(zhì)fpp的重組釀酒酵母。

17、優(yōu)選的，一種重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將編碼氨基酸序列如seq?id?no.2所示的α-石竹烯合成酶aohs1的基因克隆入表達(dá)載體中得到重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞釀酒酵母菌中，構(gòu)建得到重組釀酒酵母菌株。

18、優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為yep352載體；所述宿主細(xì)胞釀酒酵母菌為釀酒酵母cen.pk2-1ca菌株，或者，以釀酒酵母cen.pk2-1ca菌株為出發(fā)菌株構(gòu)建的產(chǎn)前體物質(zhì)fpp的重組釀酒酵母。

19、上述α-石竹烯合成酶aohs1、編碼基因或α-石竹烯合成酶aohs1相關(guān)的生物材料在制備α-石竹烯合成酶aohs1中的應(yīng)用。

20、上述α-石竹烯合成酶aohs1、編碼基因或α-石竹烯合成酶aohs1相關(guān)的生物材料在制備α-石竹烯和/或β-石竹烯中的應(yīng)用。

21、進(jìn)一步的，上述α-石竹烯合成酶aohs1、編碼基因或α-石竹烯合成酶aohs1相關(guān)的生物材料在生物合成α-石竹烯和/或β-石竹烯中的應(yīng)用。

22、所述應(yīng)用為：以法尼基焦磷酸(fpp)為底物，經(jīng)α-石竹烯合成酶aohs1催化產(chǎn)生α-石竹烯和β-石竹烯。

23、進(jìn)一步的，所述生產(chǎn)α-石竹烯和β-石竹烯的發(fā)酵培養(yǎng)基為sd-δura培養(yǎng)基：20g/l的葡萄糖，6.7g/l的ynb，0.62g/l的do?supplement(△ura-△trp-△leu)，0.06g/l的亮氨酸，0.04g/l的色氨酸，加入20％(v/v)的正十二烷進(jìn)行雙相發(fā)酵，發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間時(shí)長(zhǎng)48h，發(fā)酵溫度30℃。發(fā)酵產(chǎn)物利用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)一步利用gc-ms輔助鑒定未知發(fā)酵產(chǎn)物。

24、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

25、本發(fā)明挖掘出一種未報(bào)道過(guò)的益智來(lái)源的α-石竹烯合成酶aohs1并對(duì)其進(jìn)行了功能表征，構(gòu)建了含有該基因的重組表達(dá)載體，在釀酒酵母菌株中進(jìn)行異源表達(dá)，可通過(guò)催化法尼基焦磷酸fpp底物合成主產(chǎn)物α-石竹烯，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生少量β-石竹烯，通過(guò)gc-ms鑒定出在發(fā)酵產(chǎn)物中含有倍半萜化合物α-石竹烯和β-石竹烯，且其產(chǎn)量表明該α-石竹烯合成酶aohs1比已報(bào)道的來(lái)源于紅球姜的α-石竹烯合成酶zss1催化能力更強(qiáng)。因此本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)α-石竹烯和β-石竹烯在微生物細(xì)胞中的高效合成，有效降低生產(chǎn)成本，有利于α-石竹烯和β-石竹烯的高效生產(chǎn)，為采用合成生物學(xué)方法異源制備萜烯化合物α-石竹烯和β-石竹烯提供了技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種益智來(lái)源的α-石竹烯合成酶aohs1，其特征在于：所述α-石竹烯合成酶aohs1的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述的益智來(lái)源的α-石竹烯合成酶aohs1的基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4.權(quán)利要求1所述益智來(lái)源的α-石竹烯合成酶aohs1相關(guān)的生物材料，其特征在于：為下述生物材料中的任意一種或多種組合：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物材料，其特征在于：

7.權(quán)利要求1所述的α-石竹烯合成酶aohs1、權(quán)利要求2～3任一項(xiàng)所述的基因或權(quán)利要求4～6任一項(xiàng)所述的生物材料在制備α-石竹烯合成酶aohs1中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述的α-石竹烯合成酶aohs1、權(quán)利要求2～3任一項(xiàng)所述的基因或權(quán)利要求4～6任一項(xiàng)所述的生物材料在制備α-石竹烯和/或β-石竹烯中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1所述的α-石竹烯合成酶aohs1、權(quán)利要求2～3任一項(xiàng)所述的基因或權(quán)利要求4～6任一項(xiàng)所述的生物材料在生物合成α-石竹烯和/或β-石竹烯中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于：以法尼基焦磷酸fpp為底物，經(jīng)α-石竹烯合成酶aohs1催化產(chǎn)生α-石竹烯和β-石竹烯。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種益智來(lái)源的α?石竹烯合成酶AoHS1及其應(yīng)用，屬于萜烯生物合成領(lǐng)域。本發(fā)明的α?石竹烯合成酶AoHS1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，其可通過(guò)催化法尼基焦磷酸FPP底物合成主產(chǎn)物α?石竹烯，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生少量β?石竹烯，通過(guò)GC?MS鑒定出在發(fā)酵產(chǎn)物中含有倍半萜化合物α?石竹烯和β?石竹烯，且其產(chǎn)量表明該α?石竹烯合成酶AoHS1比來(lái)源于紅球姜的ZSS1催化能力更強(qiáng)。因此本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)α?石竹烯和β?石竹烯在微生物細(xì)胞中的高效合成，有效降低生產(chǎn)成本，有利于α?石竹烯和β?石竹烯的高效生產(chǎn)，為采用合成生物學(xué)方法異源制備萜烯化合物α?石竹烯和β?石竹烯提供了技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：李爽,錢紅菱,卓敏,朱晁誼
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中新國(guó)際聯(lián)合研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10