本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是涉及了大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、長久以來，獻(xiàn)血者血液中的單個核細(xì)胞（peripheral?blood?mononuclear?cells，pbmcs）沒有得到充分利用，而是采用離心或過濾方法將其作為廢棄物去除，造成了極大浪費(fèi)。如能將其應(yīng)用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的制備，將具有廣泛的前景和充沛的資源。

2、自然殺傷細(xì)胞（natural?killer?cell，nk）是pbmcs的重要組成細(xì)胞。源于健康獻(xiàn)血者的nk細(xì)胞表達(dá)廣泛受體，具有成熟的功能，nk細(xì)胞為人體免疫力的第一道防線，具有廣譜抗腫瘤和抗感染作用。nk細(xì)胞療法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于殺傷腫瘤和病毒感染的治療，其具有安全性良好、不存在移植物抗宿主病（gvhd）和神經(jīng)毒性的問題，為通用即用型產(chǎn)品，不需hla匹配，適用于不同個體，滿足患者隨制隨用的臨床要求。nk細(xì)胞主要存在于外周血循環(huán)中，大約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%，比例很低，而且是終末分化狀態(tài)存在。因此，要在短期內(nèi)體外大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)高純度的nk細(xì)胞是一個亟待解決的難題。

3、目前，已經(jīng)有多種體外擴(kuò)增獲得nk細(xì)胞的方法。但這些擴(kuò)增的方法，要么擴(kuò)增效率不高，一般在一百到兩百多倍，難以滿足臨床上對nk細(xì)胞數(shù)量的要求。要么需要加入腫瘤細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，擴(kuò)增的nk細(xì)胞引入了其他未知成分，存在嚴(yán)重的安全隱患。因此，開發(fā)一種體外大規(guī)模擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法是非常有必要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于此，有必要針對上述技術(shù)問題，提供大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、第一方面，一種大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其中激活nk細(xì)胞的滅活病毒為腺病毒ad5。

4、大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，具體包括如下步驟：

5、（1）將分選獲得的nk細(xì)胞加入預(yù)包被了滅活ad5病毒蛋白的孔板中，進(jìn)行激活培養(yǎng)；前5天不傳代不換液；

6、（2）在激活培養(yǎng)的第五天，全換液，同時調(diào)低活性細(xì)胞因子il-2和il-15的終濃度；

7、（3）在第五天之后，每隔一天傳代nk細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整培養(yǎng)的細(xì)胞密度。

8、進(jìn)一步的，滅活腺病毒ad5包被的終濃度為5μg/ml。

9、進(jìn)一步的，步驟（1）中，激活培養(yǎng)的培養(yǎng)基中活性細(xì)胞因子為il-2和il-15，使用的終濃度分別為1200?iu/ml和400?iu/ml。

10、進(jìn)一步的，步驟（2）中，全換液后，活性細(xì)胞因子il-2和il-15的終濃度調(diào)整為400iu/ml和200?iu/ml。

11、進(jìn)一步的，步驟（3）中，培養(yǎng)的細(xì)胞密度為?106個細(xì)胞?/ml。

12、進(jìn)一步的，分選獲得的nk細(xì)胞為純度超過98%的nk細(xì)胞。

13、第二方面，一種nk細(xì)胞，所述nk細(xì)胞由上述第一方面的方法制得。

14、第三方面，一種藥物組合物，包括：上述第二方面的nk細(xì)胞。

15、第四方面，上述第二方面的nk細(xì)胞或第三方面的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于實體瘤或血液瘤的免疫治療。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下有益效果：

17、本發(fā)明選定滅活腺病毒ad5進(jìn)行激活終末分化的nk細(xì)胞，這種滅活的腺病毒ad5不具有感染性，而且人群中普遍存在針對ad5的預(yù)存免疫反應(yīng)。滅活的ad5激活nk細(xì)胞的能力特別強(qiáng)，在無血清培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增，無飼養(yǎng)細(xì)胞和其他未知成分加入，具有良好的安全性。這種方法激活培養(yǎng)的nk細(xì)胞，在第15天的時候擴(kuò)增倍數(shù)超過800倍，而對多種腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)的殺傷作用，為未來car-nk細(xì)胞的規(guī)?；瘮U(kuò)增和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

18、應(yīng)當(dāng)理解的是，以上的一般描述和后文的細(xì)節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本發(fā)明。

19、為了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。

技術(shù)特征：

1.一種大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其特征在于，激活nk細(xì)胞的滅活病毒為腺病毒ad5。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其特征在于，滅活腺病毒ad5總蛋白的包被終濃度為5μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟（1）中，激活培養(yǎng)的培養(yǎng)基中活性細(xì)胞因子為il-2和il-15，使用的終濃度分別為1200?iu/ml和400?iu/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟（2）中，全換液后，活性細(xì)胞因子il-2和il-15的終濃度調(diào)整為400?iu/ml和200?iu/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟（3）中，培養(yǎng)的細(xì)胞密度為?106個細(xì)胞/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，其特征在于，分選獲得的nk細(xì)胞為純度超過98%的nk細(xì)胞。

8.一種nk細(xì)胞，其特征在于，所述nk細(xì)胞由權(quán)利要求1?7任一項所述的方法制得。

9.一種藥物組合物，其特征在于，包括：權(quán)利要求8所述的nk細(xì)胞。

10.權(quán)利要求8所述的nk細(xì)胞或權(quán)利要求9所述的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于實體瘤或血液瘤的免疫治療。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了大規(guī)模體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法和應(yīng)用。一種大規(guī)模體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，其中激活NK細(xì)胞的滅活病毒為腺病毒Ad5。本發(fā)明選定滅活病毒Ad5進(jìn)行激活終末分化的NK細(xì)胞，這種滅活的腺病毒激活NK細(xì)胞的能力特別強(qiáng)，在無血清培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增，無飼養(yǎng)細(xì)胞和其他未知成分加入，具有良好的安全性。這種方法激活培養(yǎng)的NK細(xì)胞，在第15天的時候擴(kuò)增倍數(shù)超過800倍，且對多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)的殺傷作用，為未來CAR?NK細(xì)胞的規(guī)模化擴(kuò)增和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：羅升學(xué),曾飛鳳,陳大偉,何博,夏文杰,梁華欽
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州血液中心（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所廣州分所、廣州器官移植配型中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10