本發(fā)明涉及一種利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，屬于農(nóng)作物遺傳育種。

背景技術(shù)：

1、花生是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，脂肪和蛋白含量高，且含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、人體必需氨基酸等主要成分。隨著人們對(duì)生活品質(zhì)的要求越來(lái)越高，高油酸、高蛋白、高蔗糖、高白藜蘆醇等品質(zhì)性狀的改良已經(jīng)成為花生育種家的重點(diǎn)關(guān)注目標(biāo)。食物的香味能極大的影響食用體驗(yàn)。著名的泰國(guó)茉莉花型香米、印度的巴斯瑪?shù)傩拖忝缀蜄|北的稻花香大米等，相比普通大米雖然價(jià)格高出幾倍，仍然受到眾多消費(fèi)者的青睞?；ㄉ谑称泛图庸ば袠I(yè)有著廣泛的用途，如榨油，加工為水煮花生、花生醬、花生甜食等休閑食品。香味對(duì)于眾多花生制品的市場(chǎng)有著重要影響。目前尚未見到香味花生種質(zhì)資源或品種的報(bào)道。培育香味花生有利于拓展花生種質(zhì)資源，對(duì)滿足花生鮮食及加工制品多樣化的市場(chǎng)需求意義重大。

2、香稻的主要香味成分為2-乙酰-1-吡咯啉(2-ap)，受badh2基因控制。badh2編碼一個(gè)甜菜堿醛脫氫酶，可催化4-氨基丁醛的氧化，后者是2-ap的前體物質(zhì)。badh2功能正常時(shí)，植株不具有香味。當(dāng)badh2突變導(dǎo)致蛋白功能喪失后，4-氨基丁醛的氧化受阻，可導(dǎo)致2-ap的積累，從而使植株產(chǎn)生香味。敲除該基因已被證明在水稻、玉米、高粱、谷子等多種作物中能促進(jìn)植株和種子香味的產(chǎn)生。

3、crsipr/cas9是一種由向?qū)na(sgrna)引導(dǎo)cas9蛋白到達(dá)基因組靶標(biāo)處，cas9蛋白切割靶標(biāo)dna雙鏈，引發(fā)細(xì)胞自身dna修復(fù)機(jī)制(主要為非同源末端連接)，從而在雙鏈斷裂處引入堿基插入、缺失、替換等突變類型的基因編輯技術(shù)。crsipr/cas9操作簡(jiǎn)單、靈活，只需要設(shè)計(jì)特異性的sgrna靶標(biāo)，就可以對(duì)基因組中幾乎所有具有合適pam(protospacer-associated?motif)序列的位點(diǎn)進(jìn)行編輯。由于其精準(zhǔn)、高效，已廣泛應(yīng)用于基因功能研究、生物制藥、作物遺傳改良等領(lǐng)域。研究表明，crispr/cas9技術(shù)在花生基因功能研究和種質(zhì)創(chuàng)制中具有巨大潛力。經(jīng)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)利用crispr/cas9技術(shù)編輯花生ahbadh基因的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是利用crispr/cas9技術(shù)對(duì)ahbadh1和ahbadh2基因進(jìn)行編輯，獲得香味性狀改良的花生突變體材料，為香味花生育種提供種質(zhì)資源。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

3、利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，以花生ahbadh1和ahbadh2基因的第1個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異的sgrna靶點(diǎn)，構(gòu)建crispr/cas9基因編輯載體，通過基因槍轟擊進(jìn)行花生的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ahbadh1a、ahbadh1b、ahbadh2a和ahbadh2b四基因敲除的香味花生突變體材料。ahbadh1包括ahbadh1a、ahbadh1b基因，分別位于花生的5號(hào)和15號(hào)染色體；ahbadh2包括ahbadh2a、ahbadh2b基因，分別位于花生的1號(hào)和11號(hào)染色體；ahbadh1a、ahbadh1b、ahbadh2a、ahbadh2b基因的核苷酸序列分別如seq?id?no.1～seq?id?no.4所示。

4、利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法中，sgrna靶點(diǎn)的序列為：

5、對(duì)于ahbadh1基因，sgrna靶點(diǎn)覆蓋ahbadh1a基因和ahbadh1b基因的第1個(gè)外顯子，靶點(diǎn)序列1為5′-ccaagaagagagctcttcataga-3′(seq?id?no.6)，5′端cca為pam序列；

6、對(duì)于ahbadh2基因，sgrna靶點(diǎn)覆蓋ahbadh2a基因和ahbadh2b基因的第1個(gè)外顯子，靶點(diǎn)序列2為5′-cccaatcccaactcgacagttgt-3′(seq?id?no.7)，5′端ccc為pam序列。

7、利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，構(gòu)建crispr/cas9基因編輯載體的方法如下：

8、(1)選用bgk012載體，加入bsai內(nèi)切酶1μl、buffer緩沖液5μl，加水補(bǔ)齊至50μl，37℃酶切1h，得到線性化載體；

9、(2)設(shè)計(jì)引物target-sense和target-antisense，以puc57-atma載體(包含一段約530bp的sgrna骨架和atu6啟動(dòng)子序列)為模板，擴(kuò)增雙靶點(diǎn)的sgrna表達(dá)盒，使用bsai內(nèi)切酶處理回收產(chǎn)物，將所得產(chǎn)物4μl與1μl線性化載體混合，加入5μl?t4連接酶，25℃反應(yīng)1h，得到連接產(chǎn)物；

10、(3)取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5a，涂板37℃過夜，挑取單菌落搖菌，并提取質(zhì)粒，用測(cè)序引物5′-gccatttgtctgcagaattg-3′進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序，保存測(cè)序正確的陽(yáng)性菌斑，得到crispr-cas9重組載體質(zhì)粒。

11、所述的利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法中，引物target-sense、target-antisense的序列為：

12、target-sense：

13、5'-aaagggtctcttgattcaactgtcgagttgggattgttttagagctagaa?a-3'(seq?idno.8)；

14、target-antisense：

15、5'-aaagggtctcaaaacagaagagagctcttcatagcaatcactacttcgac-3'(seq?idno.9)。

16、利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法中，花生的遺傳轉(zhuǎn)化方法為：以花生種子為外植體，通過誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，用基因槍轟擊法進(jìn)行花生的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)潮霉素抗性篩選，篩選后的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)花生幼苗，然后將幼苗置于生根培養(yǎng)基上，待幼苗生根，將幼苗移至土壤中，即得到具有香味性狀的香味花生突變體材料。

17、利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法在花生遺傳育種中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明有益效果：

19、1、本發(fā)明提供一種通過crispr/cas9基因編輯技術(shù)編輯花生ahbadh1和ahbadh2基因的方法。通過分別在ahbadh1和ahbadh2基因序列的第一個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的sgrna靶點(diǎn)，構(gòu)建crispr/cas9雙靶標(biāo)突變載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)ahbadh1和ahbadh2基因的定點(diǎn)敲除，獲得花生的四基因敲除突變株系。

20、2、本發(fā)明獲得的花生突變體株系具有嗅覺可辨香味，其葉片2-ap含量達(dá)8.78mg/kg，籽仁2-ap含量達(dá)0.07mg/kg，2-ap含量顯著高于野生型，為香味花生選育提供了種質(zhì)資源。

21、3、本發(fā)明可根據(jù)育種目標(biāo)實(shí)際需求不同，創(chuàng)制不同本底背景的香味花生品種或種質(zhì)資源，可用于花生的遺傳育種。

技術(shù)特征：

1.一種利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，其特征在于，以花生ahbadh1和ahbadh2基因的第1個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異的sgrna靶點(diǎn)，構(gòu)建crispr/cas9基因編輯載體，通過基因槍轟擊進(jìn)行花生的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ahbadh1a、ahbadh1b、ahbadh2a和ahbadh2b四基因敲除的香味花生突變體材料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，其特征在于，所述ahbadh1包括ahbadh1a、ahbadh1b基因，分別位于花生的5號(hào)和15號(hào)染色體；ahbadh2包括ahbadh2a、ahbadh2b基因，分別位于花生的1號(hào)和11號(hào)染色體；ahbadh1a、ahbadh1b、ahbadh2a、ahbadh2b基因的核苷酸序列分別如seq?id?no.1～seq?id?no.4所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，其特征在于，所述sgrna靶點(diǎn)的序列為：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，其特征在于，所述構(gòu)建crispr/cas9基因編輯載體的方法如下：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，其特征在于，所述引物target-sense、target-antisense的序列為：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，其特征在于，花生的遺傳轉(zhuǎn)化方法為：以花生種子為外植體，通過誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，用基因槍轟擊法進(jìn)行花生的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)潮霉素抗性篩選，篩選后的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)花生幼苗，然后將幼苗置于生根培養(yǎng)基上，待幼苗生根，將幼苗移至土壤中，即得到具有香味性狀的香味花生突變體材料。

7.一種權(quán)利要求1所述的利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法在花生遺傳育種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制香味花生的方法，利用基因編輯技術(shù)對(duì)AhBADH1和AhBADH2基因進(jìn)行編輯，分別在花生AhBADH1和AhBADH2基因的第1個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異的sgRNA靶標(biāo)，構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體，獲得AhBADH1A、AhBADH1B、AhBADH2A和AhBADH2B四基因敲除突變株系，并培育出香味花生。得到的盛花期突變株系葉片2?AP含量達(dá)到8.78mg/kg，T<subgt;2</subgt;代籽仁2?AP含量達(dá)到0.07mg/kg，具有嗅覺可辨的芳香味。本發(fā)明的改良花生材料方法為香味花生育種提供思路和技術(shù)手段。

技術(shù)研發(fā)人員：張新友,薛璐璐,石磊,黃冰艷,張忠信,代小冬,孫子淇,齊飛艷,秦利,徐靜,劉華,韓鎖義,董文召
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10