本發(fā)明涉及生物，更具體地說，一種具有美白、抗氧化、抗皺作用的海參活性多肽及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、海參是棘皮動物，是重要的海洋類食物，其高蛋白、低脂肪、低糖、富含人體必需的各種氨基酸和脂肪酸、維生素和微量元素等，具有很高的營養(yǎng)價值。海參富含蛋白質(zhì)，是制備生物活性多肽的良好來源。近年來，越來越多具有生物活性的海參多肽被挖掘出來，其具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等作用。

2、海參蛋白在水解形成肽的過程中，肽鍵被降解，這會使可解離基團增多，從而增加其親水性；肽鍵的降解也會改變其分子結(jié)構(gòu)，將蛋白內(nèi)部的疏水基團暴露出來。此外，還會改變肽的氨基酸個數(shù)和相對分子質(zhì)量，這些變化提高了海參多肽的溶解性、增加了其穩(wěn)定性，此外，與氨基酸相比，海參肽的滲透壓較低，生物安全性高。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請的目的在于提供一種海參活性多肽制備及其用途，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。

2、本申請?zhí)峁┝艘环N海參活性多肽，海參活性多肽的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

3、本發(fā)明利用硫酸銨沉淀法提取總蛋白，酶解法和凝膠層析分離純化方法獲得海參多肽，通過質(zhì)譜法測定海參多肽的氨基酸序列，分離鑒定了一種海參多肽。

4、包括以下步驟：

5、步驟一、將新鮮海參清洗干凈并切成小塊，加入適量的pbs緩沖溶液進行勻漿；勻漿后，按照體積比為1:20的比例加入20?mm?ph?7.0?tris-hcl緩沖液攪拌均勻，在4℃下攪拌浸提24小時；以10000?r/min的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，收集上清液；對上清液利用硫酸銨沉淀法提取海參總蛋白；

6、步驟二、將制備的海參總蛋白樣品100?mg，10?mm?ph7.5的pbs緩沖溶液溶解，置于在分子量大小為2000-5000da的醋酸纖維素透析袋中，對5?mm?ph?6.0的醋酸銨緩沖溶液中透析；透析后將蛋白質(zhì)溶液置于1kd的超濾柱子除鹽并濃縮，濃縮后在濃縮液中加入濃度為5000u/g的堿性蛋白酶，在ph為8，溫度40℃下，對蛋白質(zhì)進行酶解，然后經(jīng)真空冷凍干燥機凍干，得海參多肽粗品；

7、步驟三、海參多肽粗品經(jīng)sephadex?g-15凝膠柱層析進行分離純化，取2?ml上柱，用蒸餾水進行洗脫，設(shè)置流速為0.5?ml/min，檢測波長為280?nm，收集洗脫峰，反復(fù)收集同一吸收峰的組分，并進行濃縮，真空冷凍干燥機凍干，得到海參多肽分離純化物；

8、步驟四、海參多肽分離純化物經(jīng)高效液相色譜柱檢測，采用流動相為20?mm磷酸鹽緩沖溶液，流速0.5?ml/min，檢測波長為280?nm；高效液相檢測為單一峰的純化物為海參多肽單體；

9、步驟五、采用質(zhì)譜對海參多肽單體的氨基酸序列進行鑒定，得到如seq?id?no：1所示的氨基酸序列。

10、所述硫酸銨沉淀法為向上清液中加入固體(nh4)2so4至終濃度為80%，攪拌均勻，然后在4℃下靜置過夜，以10000?r/min的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，在水中充分透析，凍干。

11、本發(fā)明中利用硫酸銨沉淀法提取總蛋白的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，然后采用酶解法和凝膠層析分離純化方法獲得海參多肽，經(jīng)高效液相技術(shù)鑒定分離純化物，并通過質(zhì)譜法鑒定海參多肽的氨基酸序列，制備了海參活性多肽。

12、利用噻唑藍（mtt）法檢測海參活性多肽對鼠黑色素瘤細胞（b16-f10）細胞活力的影響。發(fā)現(xiàn)海參多肽單獨作用于細胞時，對細胞沒有毒性。經(jīng)海參多肽處理b16-f10細胞24小時后，細胞中黑色素含量和酪氨酸酶活性水平均表現(xiàn)為明顯降低，實驗結(jié)果表明所述海參多肽可以抑制細胞中酪氨酸酶的活性及降低黑色素的合成，體現(xiàn)出美白的生物活性。

13、利用體外實驗測定法檢測，海參多肽處理豬胰腺彈性蛋白酶后，與特異性底物反應(yīng)進行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物減少，實驗結(jié)果表明所示海參多肽可以明顯抑制彈性蛋白酶活性，體現(xiàn)出海參多肽具有較強的抗皺活性。

14、利用體外實驗測定法檢測海參多肽對-oh自由基、dpph自由基、o2-自由基的清除能力，通過fenton反應(yīng)的實驗結(jié)果表明海參多肽對-oh自由基具有很強的清除能力；通過dpph實驗結(jié)果表明海參多肽對dpph自由基具有很強的清除能力；通過o2-自由基清除率的實驗結(jié)果表明海參多肽具有很強的o2-自由基清除能力，體現(xiàn)出海參多肽具有很強的抗氧化活性。

15、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供一種海參活性多肽，其具有良好的美白、抗皺、抗氧化作用。

16、1、該活性多肽可以抑制小鼠黑色素瘤細胞（b16-f10）中的酪氨酸酶活性，從而抑制了黑色素的合成，降低了黑色素的含量，體現(xiàn)出良好的美白效果。

17、2、該海參活性多肽可以抑制彈性蛋白酶活性，彈性蛋白酶是水解關(guān)鍵結(jié)締組織基質(zhì)蛋白的關(guān)鍵酶，彈性蛋白酶活性的抑制可以通過保護皮膚不老化來防止紫外線或自由基對彈性纖維的損傷，從而起到抗皺作用。

18、3、該海參活性多肽可以有效清除-oh自由基、ddph自由基和o2-自由基。-oh自由基、ddph自由基、o2-自由基在體內(nèi)具有最強的氧化活性，可結(jié)合氨基酸和dna等生物大分子，導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化損傷，清除-oh、ddph和o2-自由基的能力可以體現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

技術(shù)特征：

1.一種海參活性多肽，其特征在于，海參活性多肽的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述的海參活性多肽的制備方法，其特征在于，其制備方法包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海參活性多肽的制備方法，其特征在于，所述硫酸銨沉淀法為向上清液中加入固體(nh4)2so4至終濃度為80%，攪拌均勻，然后在4℃下靜置過夜，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，在水中充分透析，凍干。

4.一種如權(quán)利要求1所述的海參活性多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述海參活性多肽在美白功效產(chǎn)品中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海參活性多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述海參活性多肽在抑制黑色素瘤細胞中的酪氨酸酶活性中的應(yīng)用。

6.一種如權(quán)利要求1所述的海參活性多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述海參活性多肽在抗皺功效產(chǎn)品中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的海參活性多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述海參活性多肽在抑制彈性蛋白酶活性中的應(yīng)用。

8.一種如權(quán)利要求1所述的海參活性多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述海參活性多肽在抗氧化功效產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的海參活性多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述海參活性多肽在清除-oh自由基、ddph自由基和o2-自由基活性中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種海參活性多肽及其制備方法和應(yīng)用，海參活性多肽氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。利用硫酸銨沉淀法提取總蛋白，然后采用酶解法和凝膠層析分離純化方法獲得海參多肽，經(jīng)高效液相技術(shù)鑒定分離純化物，并通過質(zhì)譜法鑒定，制備了海參活性多肽。經(jīng)檢測其具有良好的美白、抗皺、抗氧化作用。

技術(shù)研發(fā)人員：李銀塔,朱蘭蘭,鐘永慶,苗佳琳,王旌宇,任子鈺,張軍,彭新顏,張建明,吳麗莎,劉麗麗,呂青樺
受保護的技術(shù)使用者：山東助邦生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10