本發(fā)明涉及生物納米顆粒外泌體，具體為一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體及其應用。

背景技術：

1、骨關節(jié)炎作為一種常見且影響廣泛的退行性關節(jié)疾病，給患者的生活質量帶來了嚴重的負面影響。目前，骨關節(jié)炎的傳統(tǒng)治療方法主要包括藥物緩解癥狀、物理治療以及在嚴重情況下進行手術干預等。然而，這些方法往往只能在一定程度上減輕疼痛和改善關節(jié)功能，對于阻止疾病的進展以及促進受損關節(jié)軟骨的修復效果有限。

2、在骨關節(jié)炎的病理生理過程中，氧化應激起著關鍵的推動作用。氧化應激會導致軟骨細胞外基質的直接降解，破壞維持軟骨結構完整性和功能的關鍵成分如膠原蛋白和蛋白多糖。這不僅使得軟骨的厚度和彈性下降，引發(fā)關節(jié)疼痛和僵硬，還會打破關節(jié)內合成代謝和分解代謝的平衡，抑制基質成分的合成，同時促進分解代謝因子的表達，進一步加速軟骨的降解，阻礙其自身的修復機制。

3、滑膜組織在骨關節(jié)炎的發(fā)展中具有重要地位?；づ帕性陉P節(jié)囊的內表面，不僅能分泌滑膜液來潤滑關節(jié)，還能為關節(jié)軟骨提供必要的營養(yǎng)素和生長因子，從而在正常狀態(tài)下維持軟骨的健康和功能。在骨關節(jié)炎發(fā)生時，滑膜會釋放促炎細胞因子和酶，這些物質會進一步加劇軟骨的降解和促進關節(jié)炎癥的發(fā)展，形成一個惡性循環(huán)，加重骨關節(jié)炎的癥狀。

4、外泌體作為細胞間通信的關鍵媒介，由細胞分泌到細胞外環(huán)境中，攜帶多種生物活性物質，如蛋白質、核酸等。在生物醫(yī)藥領域，外泌體具有潛在的治療應用價值，尤其是在組織修復和再生方面展現(xiàn)出了一定的潛力。然而，現(xiàn)有的外泌體在改善骨關節(jié)炎方面的研究和應用尚存在不足。一方面，對于外泌體的來源和制備方法缺乏優(yōu)化，導致其在治療骨關節(jié)炎時的效果不夠理想；另一方面，缺乏有效的傳遞系統(tǒng)來確保外泌體能夠準確地到達關節(jié)病變部位并持續(xù)發(fā)揮作用。

5、因此，迫切需要研發(fā)一種新的基于生物納米顆粒衍生的外泌體及其應用方法，以更有效地改善骨關節(jié)炎的癥狀和延緩疾病的進展，為骨關節(jié)炎的治療提供一種創(chuàng)新且更有前景的解決方案。

技術實現(xiàn)思路

1、（一）解決的技術問題

2、針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體及其應用。

3、（二）技術方案

4、一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體的制備方法：

5、細胞培養(yǎng)步驟：

6、培養(yǎng)小鼠滑膜成纖維細胞，將其來源限定為hycyte，使用100?nm的sod3模擬物對照物質進行處理；

7、從8周齡小鼠的軟骨中分離軟骨細胞，并在含10%胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中軟骨細胞的分離過程為先使用無菌刀片將軟骨切成1?mm3碎片，然后在含有2?mg/ml?ii型膠原酶thermo的dmem/f12培養(yǎng)基中消化6?h，消化后的細胞進行離心處理后再進行培養(yǎng)；

8、外泌體分離步驟：

9、從第3-6代的經(jīng)上述處理的小鼠滑膜成纖維細胞中分離出外泌體，先從2×107細胞培養(yǎng)物上清液中依次進行300?g離心10?min去除細胞、3000?g離心15?min丟棄細胞碎片，之后將上清液以12萬g離心1h，用pbs洗滌顆粒以去除污染物，最后在12萬g下再次離心70min，純化后的顆粒在200?μl的pbs中重懸，并在-80℃下保存。

10、優(yōu)選的，所述外泌體具有圓形凸形結構，其粒徑范圍通過納米顆粒跟蹤分析確定為特定區(qū)間；

11、通過western印跡法檢測顯示外泌體標記物cd9、cd63、tsg101呈陽性標記，且經(jīng)sod3模擬物處理的滑膜成纖維細胞來源的外泌體中sod3含量顯著高于對照處理的滑膜成纖維細胞來源的外泌體。

12、優(yōu)選的，所述外泌體在制備治療骨關節(jié)炎的藥物或醫(yī)療器械中的應用；

13、體外應用：

14、軟骨細胞用10?ng/ml的il-1β刺激，用10?μg/ml外泌體處理，檢測mitoros和活性氧ros的水平，軟骨細胞外基質ecm合成相關基因col2a1和acan的表達以及基質降解相關基因mmp13和adamts5的表達；

15、體內應用：

16、在建立的小鼠oa模型中，通過手術對小鼠進行特定處理后，每兩周在關節(jié)內注射含有本發(fā)明外泌體的微球，檢測關節(jié)軟骨糖胺聚糖、sod3和acan的表達水平。

17、優(yōu)選的，在制備含有外泌體的微球時，采用以下步驟及參數(shù)：

18、制備微球的原料包含10?wt%?gelma、光引發(fā)劑和5?wt%?span80油，在微流控裝置中處理形成均勻大小的液滴，通過紫外線照射使液滴交聯(lián)；

19、將合成的微球用75%的乙醇溶液洗滌，并保存在去離子水中；

20、為進行表面改性，將微球浸泡在聚多巴胺pda溶液（2?mg/ml在10?mm?tris鹽酸，ph8.5）中6小時形成具有特定特性和功能的改性微球。

21、（三）有益的技術效果

22、本發(fā)明通過特定的細胞培養(yǎng)和外泌體分離方法，制備出具有高質量和高活性的用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體。

23、本發(fā)明通過在體外細胞實驗中應用該外泌體，顯著降低了軟骨細胞內的?mitoros和?ros?水平，阻止氧化應激對軟骨細胞的損傷，同時增加了軟骨細胞外基質關鍵成分的表達，上調了?ecm?合成相關基因并降低了基質降解相關基因的表達。

24、本發(fā)明通過將外泌體與特定微球制備技術相結合，在小鼠?oa?模型體內實驗中，實現(xiàn)了外泌體在關節(jié)內的有效傳遞和緩慢釋放，顯著保留了關節(jié)軟骨中的糖胺聚糖表達，增加了關鍵蛋白?sod3?的表達，有效緩解了骨關節(jié)炎的嚴重程度。

25、本發(fā)明通過以上創(chuàng)新設計和應用方式，為骨關節(jié)炎的治療提供了一種全新的、多方位有效的解決方案，有望在臨床應用中發(fā)揮重要作用，改善患者生活質量并減輕社會醫(yī)療負擔。

技術特征：

1.一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體的制備方法，其特征在于：制備方法如下：

2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體的制備方法，其特征在于：所述外泌體具有圓形凸形結構，其粒徑范圍通過納米顆粒跟蹤分析確定為特定區(qū)間；

3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體的制備方法制備的外泌體的應用，其特征在于：所述外泌體在制備治療骨關節(jié)炎的藥物或醫(yī)療器械中的應用；

4.根據(jù)權利要求3所述的一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體的制備方法制備的外泌體的應用，其特征在于：

技術總結
本發(fā)明涉及生物納米顆粒外泌體技術領域，且公開了一種用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體及其應用。細胞培養(yǎng)步驟：8周齡小鼠的軟骨中分離軟骨細胞，并在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有2mg/mL?II型膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)基中消化，消化后的細胞進行離心處理后再進行培養(yǎng)；外泌體分離步驟：從第3?6代的經(jīng)上述處理的小鼠滑膜成纖維細胞中分離出外泌體，先從細胞培養(yǎng)物上清液中離心，之后將上清液離心，用PBS洗滌顆粒以去除污染物，再次離心，PBS重懸。本發(fā)明通過特定的細胞培養(yǎng)和外泌體分離方法，制備出具有高質量和高活性的用于改善骨關節(jié)炎的生物納米顆粒衍生外泌體。

技術研發(fā)人員：劉明明,呂南寧,陳翀
受保護的技術使用者：連云港市第二人民醫(yī)院（連云港市臨床腫瘤研究所）
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/10