本發(fā)明屬于生物，特別關(guān)注于海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、長(zhǎng)牡蠣(crassostrea?gigas)，屬于動(dòng)物界中軟體動(dòng)物門、雙殼綱、牡蠣科、牡蠣屬。作為一種具有顯著經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物種，長(zhǎng)牡蠣在中國(guó)的海水養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)了重要地位。隨著長(zhǎng)牡蠣全基因組測(cè)序工作的完成，長(zhǎng)牡蠣等海洋貝類在功能基因的驗(yàn)證方面取得顯著進(jìn)展。但由于目前缺乏長(zhǎng)牡蠣細(xì)胞系，限制了對(duì)長(zhǎng)牡蠣基因功能和調(diào)控機(jī)制的深入研究和發(fā)掘利用，以及貝類養(yǎng)殖技術(shù)的創(chuàng)新，這已成為研究和應(yīng)用開發(fā)的主要瓶頸。

2、在海洋軟體動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)菌污染是最普遍且難以解決的問題之一。因此，采用抑菌物質(zhì)以降低細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)是至關(guān)重要的。盡管長(zhǎng)牡蠣原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)取得了一定進(jìn)步，但在組織(外套膜、鰓、消化腺和性腺)的抑菌處理和細(xì)胞分離制備技術(shù)方面仍有待完善。特別是鰓，作為長(zhǎng)牡蠣抵御病原微生物的主要防線，由于鰓組織中微生物種類繁多且數(shù)量眾多，其細(xì)胞培養(yǎng)過程中的抑菌難度更加顯著。目前，利用長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)和功能驗(yàn)證的研究還較為有限。鑒于長(zhǎng)牡蠣資源的豐富性，其在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用中具有極大的潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑體積比為65.895-70.895：29.105-34.105；所述添加劑為細(xì)胞生長(zhǎng)類組分和促進(jìn)細(xì)胞增殖類組分。

4、所述細(xì)胞生長(zhǎng)類組分體積占長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基體積的28％～33％，其成分為長(zhǎng)牡蠣血清，fbs，抗生素，混合鹽(cacl2、nacl、kcl、mgcl2)，硫酸鹽(mgso4)。

5、所述促進(jìn)細(xì)胞增殖類組分體積占長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基體積的1.105％，其為poly-d-lysine，hepes緩沖劑，egf，β-巰基乙醇。

6、所述長(zhǎng)牡蠣血清與fbs的體積比為0.5～1。

7、所述長(zhǎng)牡蠣血清為將長(zhǎng)牡蠣血淋巴離心取上清，0.22μm濾膜過濾除菌，即得；離心條件為：離心溫度4℃，離心轉(zhuǎn)速800×g，離心15min。

8、所述抗生素包括以下組分：10ku/ml青霉素，10mg/ml鏈霉素，5mg/ml慶大霉素。

9、所述混合鹽包括以下成分：0.6g?cacl2、20.2g?nacl、0.54g?kcl、3.9gmgcl2，純水定容至100ml。

10、所述硫酸鹽為mgso4，配制濃度為50g/l。

11、所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為l-15培養(yǎng)基。

12、一種所述的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基的應(yīng)用，所述培養(yǎng)基在原代培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞中的應(yīng)用。

13、一種原代培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞的方法：

14、(1)將長(zhǎng)牡蠣鰓組織用消毒液殺菌后剪碎；

15、(2)將步驟(1)中的剪碎組織通過組織裂解液制成長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞懸液；

16、(3)使用權(quán)利要求1所述原代培養(yǎng)基將步驟(2)獲得長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞懸液稀釋，而后加入至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

17、所述步驟(2)中的所述組織裂解液為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶與edta的混合液；裂解液各成分在長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞懸液中終濃度依次為：2.5mg/ml胰蛋白酶，5mg/ml木瓜蛋白酶，0.5mg/ml膠原蛋白酶，0.2mg/ml?edta；其中，剪碎的組織塊與組織裂解液之間體積的比例為1:1。

18、所述組織裂解液酶解時(shí)間為15min，酶解溫度為37℃。

19、所述步驟(3)中培養(yǎng)的條件為：18℃，靜置培養(yǎng)。

20、所述培養(yǎng)瓶為使用poly-d-lysine溶液對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行處理，0.1mg/ml的poly-d-lysine過夜鋪被后吸走多余poly-d-lysine溶液，超凈內(nèi)干燥1小時(shí)，待用。

21、所述步驟(1)中所述消毒液為75％酒精消毒液、洗必泰消毒液和抗生素消毒液三種。各消毒液的作用時(shí)間為：75％酒精消毒液浸泡10-15s，洗必泰消毒液10min，抗生素消毒液15min。消毒液使用之后需要用pbs進(jìn)行沖洗。

22、所述抗生素消毒液包括以下成分：100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、50μg/ml慶大霉素、10μg/ml卡那霉素、2μg/ml兩性霉素b和100μg/ml氯霉素，溶劑為純水。

23、本發(fā)明原代培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加提供細(xì)胞生長(zhǎng)類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和促進(jìn)細(xì)胞增殖物質(zhì)，兩類物質(zhì)共同保證體外培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。

24、其中，細(xì)胞生長(zhǎng)類組分中的長(zhǎng)牡蠣血清為樣品提供了長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)提供氨基酸、微量元素、離子、激素等必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；并且其也具有抗菌作用，并且配合抗生素防止細(xì)菌污染培養(yǎng)基；同時(shí)其他成分模擬海水鹽度，還原長(zhǎng)牡蠣半開放系統(tǒng)下的海水鹽度；

25、促進(jìn)細(xì)胞增殖物質(zhì)中的poly-d-lysine是輔助貼壁因子，包被在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，其促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行貼壁繁殖；成分中緩沖劑維持培養(yǎng)基的ph，以及egf激活受體胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸激酶，從而啟動(dòng)dna合成和細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；β-巰基乙醇中和細(xì)胞培養(yǎng)基中積累的氧自由基從而改善細(xì)胞周圍環(huán)境。

26、本發(fā)明對(duì)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，該方法操作簡(jiǎn)單，且培養(yǎng)的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞細(xì)胞密度大，形態(tài)好。

27、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：

28、本發(fā)明培養(yǎng)基可用于長(zhǎng)牡蠣鰓原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并能夠更好的維持體外培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)；該培養(yǎng)基中加入了特定比例的長(zhǎng)牡蠣血清，使用該比例的培養(yǎng)基對(duì)長(zhǎng)牡蠣鰓原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)能夠有效抑菌；本申請(qǐng)還提供了一種該培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，該方法操作簡(jiǎn)單，且培養(yǎng)的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞細(xì)胞密度大，形態(tài)好，抗菌能力強(qiáng)；具體為：

29、1.本申請(qǐng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞培養(yǎng)基，通過加入特定比例的長(zhǎng)牡蠣血清，使得培養(yǎng)基有更強(qiáng)的抑菌作用，能夠更好的維持體外原代培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝；

30、2.本申請(qǐng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞培養(yǎng)基在培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞中的應(yīng)用，該方法操作簡(jiǎn)單，且培養(yǎng)的長(zhǎng)牡蠣鰓原代細(xì)胞抗菌能力強(qiáng)。

技術(shù)特征：

1.一種長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑體積比為65.895-70.895：29.105-34.105；所述添加劑為細(xì)胞生長(zhǎng)類組分和促進(jìn)細(xì)胞增殖類組分。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述細(xì)胞生長(zhǎng)類組分體積占長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基體積的28％～33％，其成分為長(zhǎng)牡蠣血清，fbs，抗生素，混合鹽(cacl2、nacl、kcl、mgcl2)，硫酸鹽(mgso4)；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述長(zhǎng)牡蠣血清與fbs的體積比為0.5～1。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述長(zhǎng)牡蠣血清為將長(zhǎng)牡蠣血淋巴離心取上清，0.22μm濾膜過濾除菌，即得；離心條件為：離心溫度4℃，離心轉(zhuǎn)速800×g，離心15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為l-15培養(yǎng)基。

6.一種權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于：所述培養(yǎng)基在原代培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞中的應(yīng)用。

7.一種原代培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞的方法，其特征在于：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的所述組織裂解液為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶與edta的混合液；裂解液各成分在長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞懸液中終濃度依次為：2.5mg/ml胰蛋白酶，5mg/ml木瓜蛋白酶，0.5mg/ml膠原蛋白酶，0.2mg/ml?edta；其中，剪碎的組織塊與組織裂解液之間體積的比例為1:1。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)中培養(yǎng)的條件為：18℃，靜置培養(yǎng)。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述培養(yǎng)瓶為使用poly-d-lysine溶液對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行處理，0.1mg/ml的poly-d-lysine過夜鋪被后吸走多余poly-d-lysine溶液，超凈內(nèi)干燥1小時(shí)，待用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別關(guān)注于海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞原代培養(yǎng)基及其應(yīng)用。培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑體積比為65.895?70.895：29.105?34.105；所述添加劑為細(xì)胞生長(zhǎng)類組分和促進(jìn)細(xì)胞增殖類組分。本發(fā)明培養(yǎng)基可用于長(zhǎng)牡蠣鰓原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并能夠更好的維持體外培養(yǎng)長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)；該培養(yǎng)基中加入了特定比例的長(zhǎng)牡蠣血清，使用該比例的培養(yǎng)基對(duì)長(zhǎng)牡蠣鰓原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)能夠有效抑菌；本申請(qǐng)還提供了一種該培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，該方法操作簡(jiǎn)單，且培養(yǎng)的長(zhǎng)牡蠣鰓細(xì)胞細(xì)胞密度大，形態(tài)好，抗菌能力強(qiáng)。

技術(shù)研發(fā)人員：王玲玲,張林芳,張學(xué)書,宋林生,李明,李德良
受保護(hù)的技術(shù)使用者：大連海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19