本發(fā)明屬于生物合成及化學合成結(jié)合領域，具體涉及一種利用生物合成法及化學合成法制備角鯊烷的方法。

背景技術(shù)：

1、角鯊烷是一種飽和烴，分子式為c30h62，由高度不飽和的角鯊烯完全氫化而得，為無色透明粘稠油狀液體，由于其具有高度的滋潤性和保濕性，且易于被皮膚吸收，化學穩(wěn)定性高，還具有提高免疫力、抗氧化、促進大腦發(fā)育、調(diào)節(jié)血脂和改善視力等多種功效，在營養(yǎng)保健和制藥工業(yè)中具有巨大的潛力。角鯊烷的來源主要有四種：從鯊魚肝臟中提取、人工合成、植物甘蔗發(fā)酵和橄欖提取。鯊魚肝臟大約占一條鯊魚體重的25％，含有大約50％的油，油中80％是角鯊烯。一般來說，生產(chǎn)一噸角鯊烯需要大約3000條鯊魚的肝臟。但由于環(huán)保和可持續(xù)性的考慮，現(xiàn)在更多地以植物角鯊烯為原料，通過加氫的方式來獲取角鯊烷。目前的制備方法都存在各種各樣的缺陷，化學合成方法存在條件苛刻復雜，需要高溫高壓，污染較大，轉(zhuǎn)化率低等諸多挑戰(zhàn)；而從植物中提取也存在破壞生態(tài)環(huán)境，培育時間長等問題。因此，研發(fā)一種工藝條件溫和、操作簡單、環(huán)保、成本低，收率高、產(chǎn)物分離純化簡單、產(chǎn)品純度好的角鯊烷的制備方法，顯得至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有路徑短、效率高、原料易得、安全性高、收率高、產(chǎn)物分離純化簡單、產(chǎn)品純度好、環(huán)境友好等特點的利用生物合成法及化學合成法制備角鯊烷的方法。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

3、利用生物合成法及化學合成法制備角鯊烷的方法，包括如下步驟：

4、(1)生物合成：

5、1)克隆活化角鯊烯合成酶基因erg9以及ura營養(yǎng)缺陷型基因leu2；將所述基因erg9和所述基因leu2共同轉(zhuǎn)化至釀酒酵母工程菌株sc027的感受態(tài)細胞中，得到重組菌；

6、2)接所述重組菌單菌落于sd-ura液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12-24h,得到種子液；

7、3)將步驟2)獲得的種子液在sd-ura液體培養(yǎng)基，在10-50℃，轉(zhuǎn)速為110-330rpm進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；在培養(yǎng)24h時添加終濃度為10g/l的半乳糖進行蛋白的誘導表達；在培養(yǎng)30h和54h時各添加終濃度為10g/l的無水乙醇；在培養(yǎng)96小時，離心獲得菌體，破壁處理，用己烷萃取，旋蒸去除有機溶劑，獲得角鯊烯；

8、(2)化學合成：

9、將乙醇加入到反應容器中，加入鈀催化劑，將反應容器中的空氣置換成氫氣，加入所述角鯊烯，使角鯊烯溶解，在反應溫度30-50℃下，反應，得到角鯊烷；所述鈀催化劑摩爾占角鯊烯摩爾的5％。

10、所述基因erg9的核酸序列如seq?id?no.1所示；所述基因leu2的核酸序列如seqid?no.2所示。

11、所述步驟(1)的2)為：接所述重組菌單菌落于sd-ura液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床中，220rpm，培養(yǎng)24h,得到種子液。

12、步驟(2)中，所述反應的溫度為50℃。

13、鈀催化劑為10％鈀碳，5％鈀碳，3％鈀碳，2％鈀碳，1％鈀碳，氯化鈀，醋酸鈀或氧化鈀。

14、本發(fā)明的有益效果

15、本發(fā)明通過微生物發(fā)酵法獲得角鯊烯，避免了現(xiàn)有技術(shù)制備角鯊烯存在的不足，本發(fā)明的方法制備的角鯊烷產(chǎn)品收率在95.5％以上。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的化學合成角鯊烷的方法相比，條件更溫和，污染更低，操作簡單，收率高，產(chǎn)物分離純化簡單，產(chǎn)品純度好。

技術(shù)特征：

1.利用生物合成法及化學合成法制備角鯊烷的方法，其特征是包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述基因erg9的核酸序列如seq?id?no.1所示；所述基因leu2的核酸序列如seq?id?no.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)的2)為：接所述重組菌單菌落于sd-ura液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床中，220rpm，培養(yǎng)24h,得到種子液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述反應的溫度為50℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于所述鈀催化劑為10％鈀碳，5％鈀碳，3％鈀碳，2％鈀碳，1％鈀碳，氯化鈀，醋酸鈀或氧化鈀。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種利用生物合成法及化學合成法制備角鯊烷的方法，步驟為：(1)生物合成：1)克隆活化角鯊烯合成酶基因ERG9以及Ura營養(yǎng)缺陷型基因leu2；將上述基因共同轉(zhuǎn)化至菌株Sc027中，得到重組菌；2)制備重組菌種子液；3)種子液進行蛋白的誘導表達；在培養(yǎng)30h和54h時各添加終濃度為10g/L的無水乙醇；在培養(yǎng)96小時，離心獲得菌體，破壁，萃取，去除有機溶劑，獲得角鯊烯；(2)化學合成：將乙醇加入到反應容器中，加入鈀催化劑，在氫氣氛，加入角鯊烯，反應，得到角鯊烷；產(chǎn)品收率在95.5％以上。本發(fā)明的方法，條件溫和，污染更低，操作簡單，收率高，產(chǎn)物分離純化簡單，產(chǎn)品純度好，97.4％以上。

技術(shù)研發(fā)人員：喬建軍,勵文豪,葉晶晶,李偉國,閆曉光,張萬澤
受保護的技術(shù)使用者：天津大學浙江研究院（紹興）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19