本發(fā)明屬于生物解毒劑，具體涉及綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法。

背景技術：

1、嘔吐毒素，學名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol,?don），是飼料中一種常見的霉菌毒素，極易對豬產生毒害作用。don對豬產生的生殖毒性主要表現(xiàn)在don可抑制母豬子宮細胞增殖，阻礙卵母細胞和胚胎發(fā)育；導致豬卵巢氧化損傷，卵巢顆粒細胞的形態(tài)變化和凋亡，并抑制細胞增殖；導致公豬睪丸支持細胞結構破壞、細胞周期停滯和氧化應激。此外，don對豬胎盤滋養(yǎng)層（ptr）細胞也產生了毒害作用，具體表現(xiàn)在細胞活力下降、細胞增殖抑制、抗氧化能力下降和遷移能力下降。

2、綠原酸（chlorogenic?acid,?cga），是由咖啡酸（caffeic?acid）和奎尼酸（1-hydroxyhexahydrogallic?acid）產生的縮醛酸。它是植物在有氧呼吸過程中通過莽草酸途徑產生的一種苯基丙烯酸酯多酚化合物。研究表明cga可以提高精液中精子活力和質膜完整性；提高體外成熟期間豬卵母細胞的成熟、受精和發(fā)育能力，并減少熱應激損傷；改善豬受精卵和胚胎發(fā)育。因此，cga能夠改善豬的繁殖性能。關于cga對豬胎盤滋養(yǎng)層細胞的影響，目前尚無報道。

3、現(xiàn)有技術（戴超輝等，嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的細胞模型構建方法，申請?zhí)枺?02411040253.1）提及到don對豬胎盤滋養(yǎng)層（ptr）細胞的毒害作用，但并沒有給出具體的解決方案?，F(xiàn)有技術（尹清強等，綠原酸化合物在制備治療由don引起炎癥的藥物中應用，申請?zhí)枺?01911221469.7）提及到綠原酸對嘔吐毒素誘導豬腸道上皮細胞炎癥和凋亡的保護作用，但并不涉及對豬胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和抗氧化能力的影響。鑒于妊娠早期胚胎附植對產仔數(shù)的重要影響，而胎盤滋養(yǎng)層細胞又直接決定胚胎附植的效率，本發(fā)明旨在通過探究cga的安全濃度和處理時間，評估cga對don誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的緩解效果，為利用cga改善豬繁殖性能提供新的思路和更多試驗依據(jù)。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，優(yōu)化了綠原酸處理豬胎盤滋養(yǎng)層細胞的條件，包括cga的安全濃度和處理時間，以及評估cga對don誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的緩解效果，將為利用cga改善豬繁殖性能提供新的思路和更多試驗依據(jù)。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明的實施例提供綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，包括以下步驟：

3、步驟一、將豬胎盤滋養(yǎng)層細胞接種至96孔板，更換培養(yǎng)基，加入cga處理細胞，cga濃度設定為：0、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml；時間設定為：24h、48h和72h后；處理結束后每孔加入10μl的cck-8溶液，在37℃下恒溫孵育2h，用酶標儀檢測在450nm處的吸光度值，計算細胞存活率，篩選出cga在ptr細胞中的安全劑量和處理時間；

4、步驟二、將豬胎盤滋養(yǎng)層細胞接種至96孔板，更換培養(yǎng)基，設置4個處理組，包括：nc對照組、don處理組、cga處理組和don+cga處理組；其中，don濃度設定為0.5μg?/ml，cga濃度設定為：50μg?/ml；時間設定為48h，處理結束后每孔加入10μl的cck-8溶液，在37℃下恒溫孵育2h，用酶標儀檢測在450nm處的吸光度值，計算細胞存活率，評估cga對?don誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞活力抑制的緩解效果；

5、步驟三、將豬胎盤滋養(yǎng)層細胞接種至12孔板，設置4個處理組，包括：nc對照組、don處理組、cga處理組和don+cga處理組；其中，don濃度設定為0.5?μg?/ml，cga濃度設定為：50μg?/ml；時間設定為48h；處理結束后收集細胞總rna，反轉錄成cdna，利用2-δδct方法計算基因的相對表達水平；收集細胞總蛋白，利用western?blot分析蛋白表達水平，評估cga對don誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖抑制、氧化應激和遷移抑制的緩解效果；

6、步驟四、利用步驟三中12孔板培養(yǎng)豬胎盤滋養(yǎng)層細胞，待細胞密度達90%后，用10μl槍頭垂直于培養(yǎng)板底面畫線制造劃痕，在48h處統(tǒng)計各組細胞的劃痕寬度，評估cga對don誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞遷移能力抑制的緩解效果，得到cga緩解don誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法。

7、其中，步驟一和步驟二中所述豬胎盤滋養(yǎng)層ptr細胞在試驗前進行處理：將豬胎盤滋養(yǎng)層ptr細胞接種至含10%胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液中，置于含5%co2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，長滿后消化傳代。

8、其中，步驟三中，所述基因表達水平表現(xiàn)于針對ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip為目的基因對不同處理組ptr細胞進行目的基因表達水平檢測，并以gapdh為內參對目的基因的表達進行均一化。步驟三中，所述蛋白表達水平表現(xiàn)于針對ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip為目的蛋白對不同處理組ptr細胞進行目的蛋白表達水平檢測，并以β-actin為內參對目的蛋白條帶的灰度值進行均一化。

9、其中，步驟四中，計算細胞劃痕愈合率采用以下公式：

10、細胞劃痕愈合率(%)?=［（t0時劃痕寬度值-tt時劃痕寬度值）/t0時劃痕寬度值］×100。

11、本發(fā)明上述技術方案的有益效果如下：

12、本發(fā)明優(yōu)化了綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，包括cga的安全濃度和處理細胞的時間，以不同濃度cga處理ptr細胞，通過cck-8檢測細胞存活率，確定cga處理ptr細胞的安全濃度為25-75μg/ml，處理時間為48?h以內。以不同處理組ptr細胞針對ccnd1、cdk4?、sod1、cat和cemip為目的基因利用2-δδct方法計算基因的相對表達水平，利用western?blot檢測蛋白的表達水平，并以細胞劃痕實驗檢測ptr細胞遷移能力，評估cga對don的緩解效果。本發(fā)明確定cga的緩解作用表現(xiàn)在cga能夠緩解don誘導的ptr細胞活力抑制、增殖抑制、遷移抑制和抗氧化能力下降，最終確定50μg/ml的cga處理ptr細胞48h可顯著緩解don誘導的ptr細胞損傷，將為利用cga改善豬繁殖性能提供新的思路和更多試驗依據(jù)。

技術特征：

1.一種綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，其特征在于，步驟一和步驟二中所述豬胎盤滋養(yǎng)層細胞在試驗前進行處理：將豬胎盤滋養(yǎng)層細胞接種至含10%胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液中，置于含5%co2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，長滿后消化傳代。

3.根據(jù)權利要求1所述的綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，其特征在于，步驟三中，所述基因表達水平表現(xiàn)于針對ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip為目的基因對不同處理組的豬胎盤滋養(yǎng)層細胞進行目的基因表達水平檢測，并以gapdh為內參對目的基因的表達進行均一化；步驟三中，所述蛋白表達水平表現(xiàn)于針對ccnd1、cdk4、sod1、cat和cemip為目的蛋白對不同處理組的豬胎盤滋養(yǎng)層細胞進行目的蛋白表達水平檢測，并以β-actin為內參對目的蛋白條帶的灰度值進行均一化。

4.根據(jù)權利要求1所述的綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，其特征在于，步驟四中，計算細胞劃痕愈合率采用以下公式：

技術總結
本發(fā)明公開了一種綠原酸緩解嘔吐毒素誘導豬胎盤滋養(yǎng)層細胞損傷的方法，優(yōu)化了CGA處理豬胎盤滋養(yǎng)層pTr細胞的條件，包括處理濃度和處理時間，以及對DON緩解效果的評估，對進一步利用CGA緩解霉菌毒素引起的細胞毒性提供重要的實驗材料和技術方法。

技術研發(fā)人員：程金花,戴超輝,孔明華,李碧俠,李輝,趙為民,付言峰,王學敏,廖超,閆俊書,陳彥羽
受保護的技術使用者：江蘇省農業(yè)科學院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/10