本發(fā)明非天然氨基酸插入，具體涉及一種在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬南到y(tǒng)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)乙?；?，作為翻譯后修飾的重要一環(huán)，由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(hats)和賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(kats)催化，將乙酰輔酶a(accoa)的乙?；珳?zhǔn)轉(zhuǎn)移至賴氨酸上，其過程受accoa濃度調(diào)控。最初，組蛋白的乙?；粡V泛揭示，迅速引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的關(guān)注。乙酰化不僅限于組蛋白，還廣泛影響非組蛋白。例如，在p53的關(guān)鍵位點(diǎn)，乙?；⒄{(diào)其穩(wěn)定性和功能，深刻影響細(xì)胞命運(yùn)。這凸顯了賴氨酸乙?；谏^程中的關(guān)鍵作用，激發(fā)了科學(xué)家對(duì)乙?；瘷C(jī)制及其效應(yīng)的深入探索。

2、科學(xué)家們好奇：乙?；芊褡鳛榫_調(diào)控蛋白功能的“開關(guān)”？它如何在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)包括活性、穩(wěn)定性、相互作用及定位在內(nèi)的多種變化？不同賴氨酸位點(diǎn)的乙酰化是否賦予蛋白更多樣的調(diào)控能力？然而，探究這些問題面臨著巨大的挑戰(zhàn)。生理?xiàng)l件下，乙?；{(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，難以精準(zhǔn)控制。傳統(tǒng)方法也難以全面模擬乙?；恼鎸?shí)狀態(tài)。因此，乙?；亟M蛋白的表達(dá)技術(shù)創(chuàng)新成為關(guān)鍵。我們需要更精準(zhǔn)、高效的工具來修飾乙?；鞍?，揭示其調(diào)控機(jī)制，為疾病治療和藥物研發(fā)提供支持。

3、基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)(gce)通過將非天然氨基酸(ncaas)引入蛋白質(zhì)，極大地?cái)U(kuò)展了蛋白質(zhì)研究的可能性。gce的核心在于開發(fā)了與細(xì)胞自然翻譯機(jī)制不同的aars/trna對(duì)，這些酶能精確識(shí)別并結(jié)合ncaas。在前期研究中，科學(xué)家們通過使用基于巴氏甲烷八疊球菌(methanosarcinamazei)來源的乙酰化賴氨酰trna合成酶kacrs/trna對(duì)，將化學(xué)合成的kac定點(diǎn)插入至目標(biāo)蛋白，獲得乙?；揎椫亟M蛋白。盡管以上方法從外源添加了高達(dá)5-20mm的kac，但是乙?；亟M蛋白產(chǎn)量通常較低，且技術(shù)過程相對(duì)復(fù)雜、表達(dá)成本高昂。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有乙?；爰夹g(shù)存在的效率問題和成本問題，本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬南到y(tǒng)和應(yīng)用，利用該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)“一鍋法”蛋白質(zhì)定點(diǎn)乙?；揎棽呗裕撓到y(tǒng)能夠在大腸桿菌或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)乙?；嚢彼?kac)的生物合成和定點(diǎn)插入，并提供了該的系統(tǒng)的具體應(yīng)用方法。

2、技術(shù)方案：為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬南到y(tǒng)，所述系統(tǒng)包括一種編碼乙?；嚢滨?trna合成酶的基因，以及編碼氨基酸序列如seqid?no:1-10任意一種所示乙?；嚢彼岷铣擅傅幕颉?/p>

4、作為具體實(shí)施方案，所述細(xì)為原核細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞；優(yōu)選的，所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或人體細(xì)胞。

5、作為具體實(shí)施方案，所述乙?；嚢滨?trna合成酶的氨基酸序列如seq?id?no:11所示。所述乙?；嚢滨?trna合成酶是基于巴氏甲烷八疊球菌(methanosarcinamazei)來源的乙酰化賴氨酰trna合成酶kacrs。

6、作為具體實(shí)施方案，所述系統(tǒng)還包括與所述編碼乙酰化賴氨酰-trna合成酶的基因配對(duì)的trna，其核苷酸序列如seq?id?no:12所示。

7、第二方面，本發(fā)明提供了所述的系統(tǒng)在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙酰化賴氨酸的應(yīng)用。

8、作為具體實(shí)施方案，所述細(xì)胞為原核細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞；優(yōu)選的，所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或人體細(xì)胞；更優(yōu)選的，所述細(xì)胞為大腸桿菌bl21(de3)或者bl21-ai，或者為人胚腎細(xì)胞hek293t。

9、作為具體實(shí)施方案，所述應(yīng)用包括：將包含編碼乙酰化賴氨酰-trna合成酶基因的重組質(zhì)粒和包含乙酰化賴氨酸合成酶基因的重組質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，或者將包含編碼乙酰化賴氨酰-trna合成酶基因和乙?；嚢彼岷铣擅富虻闹亟M質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含乙?；嚢彼岬哪繕?biāo)蛋白；優(yōu)選的，所述目標(biāo)蛋白為sfgfp。

10、第三方面，本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬姆椒?，所述方法包括將包含編碼乙?；嚢滨?trna合成酶基因的重組質(zhì)粒和包含編碼氨基酸序列如seq?id?no:1-10任意一種所示乙酰化賴氨酸合成酶基因的重組質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，或者將包含編碼乙酰化賴氨酰-trna合成酶基因和編碼氨基酸序列如seq?id?no:1-10任意一種所示乙?；嚢彼岷铣擅富虻闹亟M質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含乙酰化賴氨酸的目標(biāo)蛋白。

11、第四方面，本發(fā)明提供了一種乙?；嚢彼岷铣擅?，所述乙酰化賴氨酸合成酶的氨基酸序列如seq?id?no:1-10任意一種所示。

12、第五方面，本發(fā)明提供了上述乙?；嚢彼岷铣擅傅幕?。

13、第六方面，本發(fā)明提供了所述的乙酰化賴氨酸合成酶，所述的基因在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙酰化賴氨酸的應(yīng)用。

14、與現(xiàn)有技術(shù)中需要外源添加kac相比，利用本發(fā)明提供的系統(tǒng)，則省去了這一步驟，并顯著提高了乙酰化重組蛋白產(chǎn)量。以nmgnat為例，在相同的培養(yǎng)條件和時(shí)間下，通過nmgnat生物合成kac和定點(diǎn)插入sfgfp時(shí)，sfgfp149kac的蛋白產(chǎn)量高達(dá)2.58mg/l，接近野生型sfgfp蛋白的產(chǎn)量3.45mg/l；而外源性添加5mm?kac，sfgfp149kac的蛋白產(chǎn)量?jī)H為0.564mg/l，遠(yuǎn)低于生物合成組。因此，本發(fā)明不僅豐富了乙?；嚢彼岷铣擅傅姆N類，還創(chuàng)新性地提出了一種無需外源添加kac、直接在大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效合成并定點(diǎn)插入kac的系統(tǒng)和方法，具有重要的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。

15、有益效果：與傳統(tǒng)的乙?；揎椫亟M蛋白表達(dá)技術(shù)相比，本發(fā)明顯著改進(jìn)了方法，不再需要將化學(xué)合成的kac外源性添加到培養(yǎng)基中。相反，本發(fā)明利用前述10種乙?；嚢彼岷铣擅负鸵阴；嚢滨rna合成酶kacrs/trna對(duì)，通過創(chuàng)新的“一鍋法”，直接在活細(xì)胞中將生物合成的kac位點(diǎn)特異性地?fù)饺肽繕?biāo)蛋白質(zhì)中。這種方法不僅省去了kac的化學(xué)合成和提純步驟，還極大地提升了重組蛋白乙?；揎椀男屎吞禺愋?。在大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的應(yīng)用中，nmgnat均展現(xiàn)出最高的kac生物合成效率，凸顯了其在蛋白質(zhì)乙酰化研究領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬南到y(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括一種編碼乙?；嚢滨?trna合成酶的基因，以及編碼氨基酸序列如seq?id?no:1-10任意一種所示乙?；嚢彼岷铣擅傅幕?。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙酰化賴氨酸的系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)為原核細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞；優(yōu)選的，所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或人體細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙酰化賴氨酸的系統(tǒng)，其特征在于，所述乙?；嚢滨?trna合成酶的氨基酸序列如seq?id?no:11所示；所述系統(tǒng)還包括與所述編碼乙酰化賴氨酰-trna合成酶的基因配對(duì)的trna，其核苷酸序列如seq?id?no:12所示。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬膽?yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞為原核細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞；優(yōu)選的，所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或人體細(xì)胞；更優(yōu)選的，所述細(xì)胞為大腸桿菌bl21(de3)或者bl21-ai，或者為人胚腎細(xì)胞hek293t。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：將包含編碼乙?；嚢滨?trna合成酶基因的重組質(zhì)粒和包含乙?；嚢彼岷铣擅富虻闹亟M質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，或者將包含編碼乙?；嚢滨?trna合成酶基因和乙酰化賴氨酸合成酶基因的重組質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含乙?；嚢彼岬哪繕?biāo)蛋白；優(yōu)選的，所述目標(biāo)蛋白為sfgfp。

7.一種在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬姆椒ǎ涮卣髟谟?，所述方法包括將包含編碼乙?；嚢滨?trna合成酶基因的重組質(zhì)粒和包含編碼氨基酸序列如seq?idno:1-10任意一種所示乙?；嚢彼岷铣擅富虻闹亟M質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，或者將包含編碼乙?；嚢滨?trna合成酶基因和編碼氨基酸序列如seq?id?no:1-10任意一種所示乙?；嚢彼岷铣擅富虻闹亟M質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含乙酰化賴氨酸的目標(biāo)蛋白。

8.一種乙?；嚢彼岷铣擅?，其特征在于，所述乙?；嚢彼岷铣擅傅陌被嵝蛄腥鐂eq?id?no:1-10任意一種所示。

9.編碼權(quán)利要求8所述乙?；嚢彼岷铣擅傅幕?。

10.權(quán)利要求8所述的乙酰化賴氨酸合成酶，權(quán)利要求9所述的基因在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼岬膽?yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種在細(xì)胞中生物合成和定點(diǎn)插入乙?；嚢彼?Kac)的系統(tǒng)及其應(yīng)用。所述系統(tǒng)包括一種編碼乙?；嚢滨?tRNA合成酶的基因，以及編碼氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1?10任意一種所示乙酰化賴氨酸合成酶的基因。與傳統(tǒng)的乙?；揎椫亟M蛋白表達(dá)技術(shù)相比，本發(fā)明不再需要將化學(xué)合成的Kac外源性添加到培養(yǎng)基中。相反，本發(fā)明利用前述10種乙酰化賴氨酸合成酶和乙?；嚢滨RNA合成酶KacRS/tRNA對(duì)，通過創(chuàng)新的“一鍋法”，直接在活細(xì)胞中將生物合成的Kac位點(diǎn)特異性地?fù)饺肽繕?biāo)蛋白質(zhì)中，不僅省去了Kac的化學(xué)合成和提純步驟，還極大地提升了重組蛋白乙?；揎椀男屎吞禺愋?。

技術(shù)研發(fā)人員：王南溪,譚仁祥,藏熠琦,陸銀荀,張雅楠,展夢(mèng)茹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京中醫(yī)藥大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17